پيش گفتار

يكي از معضلات بزرگي كه علم پزشكي از ديرباز با آن درگير بوده است، ارائه درماني قطعي براي بازسازي بافت هاي از كار افتاده و يا معيوب است. متداول ترين شيوه در درمان اين نوع بافت ها، روش سنتي پيوند است كه خود مشكلات عديده اي را به دنبال دارد. از جمله اين مشكلات مي توان به كمبود عضو اهدائي، هزينه بالا و اثرات جانبي حاصل از پيوند بافت بيگانه Allograft)) كه مهمترين آنها همان پس زني بافت توسط بدن پذيرنده است اشاره كرد. اين محدوديت ها دانشمندان را بر آن داشت تا راه حلي مناسب براي اين معضل بيابند.

   مهندسي بافت با عمر حدوده 1 ساله خود روشي نويد بخش در توليد گزينه هاي بيولوژيكي براي كاشتني ها (Implants) و پروتزها ارائه كرده و وعده بزرگ تهيه اندام هاي كاملاً عملياتي براي رفع مشكل كمبود عضو اهدائي را مي دهد. اهداف مهندسي بافت فراهم سازي اندام هاي كارآمد يا جايگزين هاي قسمتي از بافت براي بيماراني با ضعف يا از كارافتادگي اندام و يا بيماري هاي حاد است كه اين امر با استفاده از روش‌هاي درماني متنوع اندام مصنوعي- زيستي تحقق مي يابد. بنا به تعريف، مهندسي بافت رشته اي است كه از تركيب علم بيولوژي مواد و علم مهندسي يا به عبارتي Biotech جهت بيان ارتباطات ساختاري بافت هاي فيزيولوژيكي و طبيعي پستانداران در راستاي توسعه روش هاي نوين ترميم بافت و جايگزين سازي بافت، توسعه يافته است. مهندسي بافت شامل مباحثي نظير تركيبات نوين سلول ها، بيومواد غيرسلولي، داروها، فرآورده هاي ژني يا ژن هايي مي باشد كه قابل طراحي، تشخيص و ساخت بوده و امكان رهايش آنها به طور همزمان يا ترتيبي به عنوان عامل هاي درماني ميسر باشد. اگرچه داروها يا بيومواد غير سلولي به مواد بسياري اطلاق مي گردد اما درمان هاي منهدسي بافت در واقع منحصر به فرد هستند.

 در مهندسي بافت، سلول ها بر روي يك بستر از جنس پليمر زيست تخريب پذير بسيار متخلخل استقرار يافته، رشد و تكثير مي يابند. روند رشد اين سلول ها در جهت بازسازي بافت در سه بعد است. يكي از اساسي ترين قسمت هاي مهندسي بافت، داربست هاي زيست تخريب پذير هستند كه تحت نام Scaffold شناخته مي شوند. اين داربست ها در حقيقت بستري متخلخل با ساختاري شبيه به ماتريس برون سلولي بافت (ECM) هستند كه رشد سلول را به سمت تشكيل بافت مورد نظر جهت مي دهند. از آنجا كليه سلول هاي بدن به غير از سلول هاي سيستم خون رساني و بافت هاي جنيني خاص بر روي ECM رشد مي كنند، ايجاد يك بستر مصنوعي در محيط in vitro بسيار اهميت دارد. با رشد سلول ها بر روي داربست، داربست تخريب مي شود. جنس اين داربست ها پليمر و در بعضي موارد كامپوزيت پليمر- سراميك است. پليمر هاي متداول مورد استفاده در مهندسي بافت در جدول 1 آورده شده است.

 

 

 

 

 

 

 

پر استفاده ترين پليمر ها در مهندسي بافت پليمرهاي خانواده پلي- هيدروكسي اسيد شامل PGA , PLA و PLGA هستند كه به طور گسترده به عنوان داربست مورد استفاده قرار مي گيرند. داربست هاي كامپوزيت پليمر-سراميك در موارد ارتوپدي استفاده شده و از مهمترين سراميك هاي به كار رفته در آنها مي توان به تري كلسيم فسفات، تتراكلسيم فسفات و هيدوركسي آپاتيت اشاره كرد. علت به كارگيري سراميك ها در داربست، افزايش استحكام پليمر، چسبندگي به استخوان و قابليت تحرك رشد درون استخوان است. بهينه ترين كامپوزيت در اين مورد تركيب PLGA و هيدروكسي آپاتيت شناخته مي شود.

   مكانيزم تخريب PGA , PLA و كوپليمر هاي آنها بر اساس هيدروليز تصادفي باندهاي استري زنجيره پليمري است. محصول نهايي اين تخريب آب و  است كه به آساني از بدن دفع مي شوند. يك داربست ايده آل بايد داراي تخلخل مناسب براي انتشار مواد غذايي بوده و امكان پاكسازي مواد زائد را داشته و داراي پايداري مكانيكي مناسبي جهت تثبيت و انتقال بار باشد. علاوه بر اين، شيمي سطح ماده بايد چسبندگي سلول و علامت دهي داخل سلولي (intracellular signaling) را به نحوي ارتقاء دهد كه سلول ها فنوتيپ طبيعي خودشان را بروز دهند. براي رشد سريع سلول، داربست بايد داراي ميكروساختار بهينه باشد، فاكتورهاي مهم يك داربست عبارتند از اندازه خلل و فرج، شكل و مساحت ويژه سطح. خلل و فرج موجود در داربست در حقيقت مسيرهاي غذارساني سلول ها و دفع پسماندهاي سلولي هستند. براي مثال خلل و فرج بهينه براي رشد سلولهاي فيبروبلاست درون رست ، خلل و فرج مناسب براي بازسازي پوست يك پستاندار بالغ  30-350 , 20-125 براي بازسازي استخوان است. بنابراين هدف اصلي در ساخت داربست، كنترل دقيق اندازه خلل و فرج و تخلخل است. مورد ديگر نحوه ايجاد چسبندگي مناسب سلول به سطح داربست است كه در اين مورد هم شيوه هاي متفاوتي به كار برده مي شود، يكي از ساده ترين شيوه ها به كارگيري رشته هاي كوچك پپتيدي در پروتئين هاي ECM است كه به عنوان واسطه مسئوليت چسبندگي سلول به بيومواد را بر عهده دارند. اجزاء گوناگون سرم قابل حل (پروتئين ها، پپتيدها) و رشته RGD براي تسهيل چسبندگي سلول شناخته شده اند.

    از آنجا كه ECM بافت هاي مختلف باهم تفاوت دارد، داربست هاي مصنوعي به كار رفته براي هر بافت نيز با هم فرق مي‌كند. تهيه داربست هايي با ماتريس هاي مختلف نيازمند به كارگيري روش هاي ساخت متفاوتي است كه هر يك شيوه و كاربرد منحصر به خود را دارد. از جمله اين روش ها مي توان به
Melt Casting , Freeze Drying , Membrane Lamination , Solvent Casting

Gas Foaming , Polymerization, Phase Separation

 اشاره كرد. شكل داربست يا به عبارتي Morphology آن بايد دقيقاً شبيه بافت معيوب باشد. براي شبيه سازي شكل داربست با قسمت ناقص اندام (defect) از شيوه هاي كامپيوتري همانند CAD استفاده مي شود. داربست پردازش شده بر اساس اين الگو مورفولوژي دقيقي از ناحيه معيوب بافت خواهد داشت.

در ذيل خلاصه اي از روش هاي مهم ساخت داربست آمده است.

قالب گيري حلال (Solvent Casting)‍: قالب گيري حلال يك روش ساده براي توليد داربست مهندسي بافت است. در اين روش پليمر در يك حلال مناسب حل شده و در قالب ريخته مي شود. سپس حلال حذف گرديده و حالت پليمر را در شكل مورد نظر حفظ مي‌كند. اين شيوه به شكل هاي قابل حصول محدود مي شود. غالباً تنها طرح هاي قابل شكل‌گيري در اين روش صفحات صاف و لوله ها هستند. البته با قراردادن صفحات صاف روي هم نيز مي توان به اشكال پيچيده تر دست يافت. در اين شيوه مي توان با شستن ذراتي مانند كريستال هاي نمك كاشته شده درون پليمر كه Progen خوانده مي شود، داربست را به صورت متخلخل درآورد. مزيت اصلي قالب گيري حلال سادگي ساخت بدون احتياج به تجهيزات خاص است. همچنين از آنجا كه عمل ساخت در دماي اتاق انجام مي گيرد نرخ تخريب پليمر زيست تخريب پذير به روش قالب گيري حلال كمتر از فيلم هاي قالب گرفته شده از طريق تراكم خواهد بود. عيب اصلي قالب گيري حلال باقي ماندن احتمالي حلال سمي درون پليمر است. براي رفع اين عيب بايد به پليمر اجازه داد تا كاملاً خشك شده و سپس با استفاده از خلاء حلال باقي مانده را خارج نمود. عيب ديگر اين روش احتمال تغيير يافتن ماهيت پروتئين و ديگر مولكول هاي موجود در پليمر به واسطه استفاده از حلال است. (شكل 2)

 

 

 

 

لايه سازي غشاء (Membrane Lamination): لايه سازي غشاء روش هاي درماني از طريق سلول هاي كپسوله شده براي رهايش گسترده اي از محصولات به دست آمده از مولكول هاي كوچك (براي مثال، دوپامين، انكفالين ها) تا محصولاتي با ژن هاي بسيار بزرگ (مانند فاكتورهاي رشد، ايميونوگلوبولين ها) را در بر مي گيرد. رهايش مواد فعال در مناطق خاصي از بدن به طور سنتي توسط كپسول هاي پليمري تخريب پذير و غير تخريب پذير كه حاوي يك يا چند دارو هستند احاطه شده است. در اين حوزه مواد در حين ساخت با يك ماتريس پليمري تركيب شده و سپس بعد از مدت زماني مشخص از ميان ماده (diffusion) و يا در خلال تخريب ماده (erusion) آزاد مي شوند. در اين جا كنترل مناسب كنتيك هاي آزاد شده از اهميت خاصي برخوردار است. يك مثال در اين مورد كنتيك هاي رها شده مرتبه صفر به دست آمده از ميله هاي كوپليمر استات اتيلن- ونيل (EVAc) به كار رفته در رهايش عامل هاي شيمي درماني در مغز است. در طول دو دهه اخير محققان تلاش كرده اند كه مواد را از ناقل هاي رهايش هيبريدي زيست مصنوعي (bioartificial) كه شامل لايه هاي غشا بر سطح اجزاء سلولي كپسوله شده كه درون غشا هستند آزاد كنند. كاربرد و هدف اصلي سلول هاي كپسوله شده، درمان دردهاي مزمن بيماري پاركينسون و ديابت نوع I، همچنين ناتواني هاي ديگر ناشي از افت ترشح عملكرد سلول است كه با كاشت اندام يا درمان هاي دارويي به طور كامل قابل مداوا نيستند. كپسوله كردن بافت عموما به دو شكل انجام مي گيرد: لايه بندي غشا ميكروكپسوله و ماكرو متخلخل در ميكرو كپسوله سازي يك يا چند سلول با پراكندگي‌هاي كروي فراوان (با قطر 100-300 nm) كپسوله مي شوند. در ماكرو كپسوله سازي تعداد زيادي از سلول ها يا توده هاي سلولي در يك يا چند كپسول نسبتاً بزرگ كاشته مي شوند. مزيت روش دوم، پايداري شيميايي و مكانيكي و سادگي بازيافت در صورت نياز است. اولين دستگاهي كه به اين روش تأئيديه ايالت متحده را كسب كرده است دستگاهي به نام كبديار (Liver assist)

انجماد- خشك سازي (Freeze- Drying): اين شيوه براي توليد داربست هاي PLG بسيار متخلخل با مزيت قابليت تلفيق رشد پايه پروتئيني و فاكتورهاي تفاضلي در زمان پردازش، معرفي شده است. اين شيوه قادر به ايجاد داربست هايي با تخلخل بيشتر از 90% و كنترل خلاء و فرج هايي به اندازه 20- 200  است. اين روش پردازش شامل ايجاد يك امولسيون از طريق هموژنيزه كردن محلول پليمر- حلال و آب، سرد كردن سريع امولسيون جهت حفظ ساختار حالت مايع و حذف حلال و آب در اثر انجماد و خشك سازي است. (شكل 3)

 

 

 

 

 

 

 

 

در اين فرايند، در ابتدا دو محلول مخلوط شدني فاز آب و يك فاز آلي را تشكيل مي دهند. فاز آلي توسط حل شدن PLG با ويسكوزيته ذاتي ويژه در MC ايجاد مي شود. فاكتورهاي زيست فعال و عوامل فعال را مي توان در اين فاز حل كرد. فاز آب از آب فوق خالص به همراه آب يا بدون افزودني هاي حل شدني مختلف مانند فاكتورهاي زيست فعال هيدروفيل تشكيل شده است. سپس فاز آلي و آب در يك لوله آزمايش شيشه اي كه 40% حجم آن آب است به هم اضافه شده و دو لايه نامخلوط را شكل مي‌دهند. اين لايه هاي نامخلوط به وسيله يك همگن ساز دستي كه در سرعت هاي مختلف نتظيم مي شود همگن شده و در يك قالب مناسب (براي مثال، شيشه يا مس) ريخته مي شود سپس با گذاشتن سريع قالب بر روي بلوك مس در كنار نيتروژن مايع با دماي (~ -196⁰C) سرد مي شود. نمونه هاي فوق در يك دستگاه انجماد- خشك سازي سفارشي 20 motorr و دماي آغازين –110⁰C منجمد و خشك مي شوند. بعد از اينكه دماي داخل امولسيون براي يك ساعت در –110⁰C به تعادل رسيد، دستگاه تراكم ساز خاموش شده و دستگاه متراكم ساز و امولسيون به آرامي در طي 12h تا دماي اطاق گرم مي شوند. نمونه هاي به دست آمده در يك دستگاه خشك ساز خلا در دماي اتاق براي ذخيره سازي و حذف بيشتر هر گونه حلال باقيمانده قرارداده مي شوند.

جداسازي فاز (Phase Separation): اين روش بر اساس جداسازي فاز مايع- جامد در محلول پليمر در اثر بلورينگي حلال عمل مي‌كند. اسفنج به دست آمده در اثر فرآيند جداسازي فاز مايع- جامد داراي مورفولوژي لوله اي شكل ناهمگون با يك ساختار نردباني شكل داخلي است. اسفنج فوق با شبكه اي از خلل و فرج هاي پيوسته توسط القاي گرمايي جداسازي فاز مايع- مايع ايجاد مي شود. ماتريس رشته اي مصنوعي با فيبرهايي با قطري به مقياس نانومتر توسط فرآيند ژل سازي به وسيله القاي گرمايي تهيه مي شوند. ماتريس هاي نانو رشته اي با ساختار ماكرومتخلخل به وسيله تركيب روش پالايش پروژن و فرآيند ژل سازي به وسيله القاي گرمايي به دست مي آيند. اسفنج هاي متخلخل پليمرهاي زيست تخريب پذير و آپاتيت هاي استخواني معدني شكل توسط فرآيند جداسازي فاز مايع- جامد و فرآيند زيست تقليدي تهيه مي شوند. جداسازي فاز محلول پليمر را مي توان به چندين روش ايجاد كرد، كه شامل جداسازي از طريق غير حلال، جداسازي فاز از طريق شيميايي و جداسازي فاز از طريق گرمايي (TIPS) مي شود. در فرايندTIPS  كه يك روش نسبتاً جديد براي تهيه غشاهاي متخلخل است، دماي محلول پليمر كاهش يافته و جداسازي فاز رخ مي دهد كه فاز اول آن غني از پليمر و فاز دوم فقير از پليمر است. بعد از خارج سازي حلال از طريق عصاره گيري، تبخير يا تصعيد، پليمر موجود در فاز غني از پليمر به شكل اسكلت سخت شده و فضاهاي اشغال شده توسط حلال در فاز عاري از پليمر به صورت خلل و فرج اسفنج پليمر در مي آيند. غشاهاي به دست آمده از اين فرايند معمولاً داراي خلل و فرجي با قطر چندين ميكرومتر بوده و معمولاً براي داربست هاي مهندسي بافت مناسب نيستند. (شكل 4)

 

 

 

 

بسپارش (Ploymerization): داربست هاي به دست آمده از طريق روش بسپارش كانديدهاي خوبي براي مهندسي بافت به شمار رفته و به دليل سهولت ساخت نسبت به روش هاي ديگر ساخت داربست ارجحيت دارند. با وجوديكه پليمرهاي متخلخلي را مي توان به اين روش بسپارش كرد اما تعداد كمي از آنها منجر به داربست هاي متخلخل مي شوند. در اين روش تركيب منومر در حضور حلالي كه منومر در آن قابل حل ولي پليمر غير قابل حل است، درون قالب بسپارش مي شود. گذار حلاليت در خلال بسپارش منجر به دو فاز مي گردد، ساختار زيستي پيوسته پليمر و حلال. بدين ترتيب داربست توليده شده در نتيجه بسپارش براي ايجاد خلل و فرج هاي درهم نيازي به پالايش پروژن ندارند. اسفنج ها يا داربست هاي PHEMA ساخته شده به اين روش داراي قابليت دخول سلول بوده و حلال مازاد آنها معمولاً آب است. اسفنج هاي PHEMA به منظور افزايش حجم پستان و جايگزيني غضروف بيني نگهدارنده بين بافت قرنيه و هسته مركزي و جايگزين بافت هاي نرم به كار برده مي شوند. يكي از معايب اين اسفنج‌ها، آهكي شدن آنها پس از مرور زمان است. اين اسفنج ها قابليت تحمل اتوكلاو را داشته و به سادگي به اشكال مختلف تغيير فرم مي دهند.

اسفنج سازي گازي (Gas Foaming): روش اسفنج سازي گازي به دليل قابليت تخلخل پذيري بالا بدون به كارگيري دماي بالا يا حلال آلي حائز اهميت است. با حذف دماي بالا و حلال آلي مي توان مولكول هاي زيست فعال بزرگ شامل فاكتورهاي رشد را با حفظ فعاليت زيستي در پليمر مجتمع ساخت. پليمري كه در اين روش پردازش مي شود PLGA است. در اين روش گرانول هاي PLGA و پروژن كه معمولاً كلريد سديم است در يك كانتينر با فشار بالا (در حدود 5.5 Mpa) با CO₂به مدت 24h به تعادل مي رسند. در اين مدت گاز CO₂در پليمر كه اكنون در تعادل ترموديناميكي به حالت سيال در آمده است حل مي شود. سپس فشار را به سرعت كاهش مي دهند. افت سريع فشار سبب به هم خوردن تعادل ترموديناميكي و در نتيجه تشكيل هسته حباب هاي CO₂در پليمر مي گردد. پليمر كه پس ازكاهش فشار تمايل به رسيدن به حالت جامد دارد به شكل اسفنج منبسط ميشود. ذرات پليمري منفرد در اطراف ذرات پروژن منبسط شده و پس از پالايش پروژن فوق يك داربست بسيار متخلخل با خلل و فرج هاي باز كنترل شده به دست مي آيد. از جمله مزاياي اين روش كنترل اندازه خلل و فرج و قابليت ايجاد داربست هاي بزرگ، عدم استفاده از حلال آلي و دماي بالا را مي توان نام برد. (شكل 5)

 

 

 

 

شكل 6، طرح بسيار ساده اي از فرآيند مهندسي بافت را نمايش مي دهد. در ابتدايي ترين مرحله اين نمودار، بافت از طريق biopsy خارج مي گردد. بافت فوق مي‏تواند Autograft (بافت خود فرد) يا Allograft (بافت فرد ديگر) يا Xenograft (بافت گونه ديگر) باشد. بافت به دست آمده در اين مرحله همانند بانك خون وارد قرنطينه شده و از جنبه‏هاي مختلف بيماري زايي مانند وجود ويروس HIV يا هپاتيت C,B، و تغييرات بردارهاي ژني مورد بررسي قرار مي گيرند. بافت ها تا زمان تعيين ايمني نهايي در قرنطينه و شرايط سرد نگهداري مي شوند.

مرحله بعد شامل تست هاي ايمني است كه شامل آزمون بافت از نظر Sterility در محيط تيوگليكولات يا مواد تصويب شده ديگر،تعيين سميت توسط آزمايش LAL و تست ميكوپلاسما توسط كشت مستقيم در محيط Sentry Cell Culture مي‌شود.

پس از مراحل فوق پردازش بافت كه شامل دو قسمت گزينش و جداسازي سلول از بافت است شروع مي گردد. در مرحله جداسازي، سلول‏ها از طرق مختلف از بافت جدا مي‏شوند. اين طرق شامل روش‏هاي برون كاشت، آنزيمي، مكانيكي، تجزيه شيميايي، تزريقي و تركيبي مي‌شود. گزينش سلولي بر اساس خاصيت منحصر به فردي كه يك سلول را از ديگري متمايز مي كند مانند چگالي، اندازه، نشانه گذاري، گذرگاههاي منحصر به فرد متابوليكي و احتياجات غذايي صورت مي گيرد.

سلولهاي بدست آمده بر روي داربست كاشته شده و در محيط كشت سلولي كه شامل مخلوطي از مواد غذايي ضروري (نمك‏ها، آمينو اسيدها، ويتامين‏ها، كربوهيدرات‏ها، اسيدهاي چرب)، بافرها (تثبيت كننده‏ها) و عناصر رديابي بصورت مكمل فاكتورهاي ميتوژنيك مشتق شده از حيوان، هورمون‏هاي مصنوعي و فاكتورهاي رشد مي باشد قرار مي گيرد. انواع خاصي از سلولهاي براي تكثير نيازمند هم كشتي با سلولهاي feeder هستند.

سلولها براي مدتي معين بر روي داربست كشت يافته و سپس در محل آناتوميكي مورد نظر Transplant مي شوند.

 

لازم به ذكر است كه كليه مراحل مهندسي بافت تحت نظارت دقيق سازمان غذا و دارو (FDA) صورت مي پذيرد.

نتايج قانونمند و استاندارد شده

REGULATORY ISSUES AND STANDARDIZATION

استيون- تي- بويس

پيدايش مهندسي بافت به عنوان يك رشته تحصيلي دانشگاهي و صنعت جهاني فرصت هاي بي نظيري را در جهت يافتن روشهاي نوين معالجه براي درمان بيماريهاي مادرزادي يا اكتسابي بوجود آورده است. مهندسي بافت شامل مباحثي نظير تركيبات نوين سلولها، بيومواد غير سلولي، داروها، فراورده هاي ژني، يا ژنهايي مي باشد كه قابل طراحي تشخيص و ساخت بوده و امكان رهايش آنها به طو همزمان يا ترتيبي به عنوان عاملهاي درماني ميسر باشد. اگرچه داروها يا بيومواد غير سلولي به مواد بسياري اطلاق مي شوند اما درمانهاي مهندسي بافت درواقع منحصر به فرد هستند. بنابراين فقدان استانداردهايي كه توسط آنها اثر بخشي و ايمني مورد ارزيابي قرار گيرد. مشخصه عمومي درمانهاي مهندسي بافت در اوايل قرن بيست و يكم خواهد بود. عليرغم نبود استانداردهاي مورد نياز براي ارزيابي، مسئوليت اداره كل خوراك دارو ايالات متحده (FDA). در جهت حفاظت عموم از خطرات تهديد كننده سلامتي مرتبط با درمانهاي تحقيقي به قوت خود باقي است. FDA انتظار دارد كه درمان هاي تصويب شده براي استفاده در ايالات متحده ايمن و مؤثر باشد. معيارهاي ايمني براي تجهيزات پزشكي مستلزم برتري فوايد احتمالي نسبت به خطرات احتمالي درمان يا بيماري درمان نشده است.

معيار اثر بخشي تجهيزات بايد نشان دهنده كارآيي دستگاه براي كاربردهاي هدفمند و حتي المقدور امكان استعمال و بازگرداندن نقص فيزيولوژيكي ايجاد شده توسط بيماري در بخش قابل ملاحظه اي از جمعيت هدف باشد. اين استانداردهاي قانونمند در مورد درمانهاي مهندسي بافت درست همانند تجهيزات پزشكي متداول داروها يا مواد بيولوژيكي استفاده مي شوند. به هر حال چندگانگي در اكثر درمان هاي مهندسي بافت به همراه فقدان مستندات، ارزبابي FDA را در ايمني و تأثيرپذيري آنها دشوار مي‏سازد با اين وجود FDA با برقراري رشهاي نوين در ارزيابي ايمني و تأثير پذيري، به طور بسيار پويا نسبت به اين پتانسيل عظيم كه منافع عمومي را در راستاي مهندسي بافت در بر دارد انجام وظيفه نموده است. ابتكارات جديد FDA با اتفاق نظرهمگاني با شركت اساتيد دانشگاه، صاحبان صنايع و دولت مردان با هدف ايجاد راهنما و استانداردهايي جهت ارزيابي تركيبات و عملكرد بافت هاي مهندسي شده صورت گرفت. يكي از مهمترين اين ابتكارات شركت كردن FDA در يك كارگروهي با انجمن سنجش و مواد آمريكا (ASTM) براي پايه ريزي استانداردهاي محصولات پزشكي و مهندسي بافت است. توسعه استانداردها توسط ASTM نويد تسهيل در فرايندهاي ارزيابي معرفي بافت هاي مهندسي شده جهت به ارمغان آوردن منافع گوناگون پزشكي در كوتاهترين زمان ممكن و كمترين هزينه را مي دهد. شركت در تلاش ASTM به منظور توسعه استاندردها، داوطلبانه بوده و براي عموم آزاد است. اين امر بيشترين امكان را در پايه ريزي استانداردهاي جامع براي مهندسي بافت فراهم نموده و با استانداردهاي بين المللي همخواني دارد. همچنين پايه علمي گسترده اي در علوم پايه و پزشكي براي FDA ايجاد مي‌كند. اين فصل چندين موضوع ويژه ضوابط درمانهاي مهندسي بافت را مورد بررسي قرار مي دهد. البته اين مبحث هيچ گونه سياست يا موضع فكري را از FDA نشان نداده و در حوزه خود نيز جامع نمي باشد.

-ملاحظات ايمني                                                            SAFETY CONSIDERATION

بدليل تشكيل اجزاي بنيادي بافت از سلولها، اكثر درمانهاي مهندسي بافت شامل سلولها مي شوند علاوه بر اين مزيت اساسي مهندسي بافت، نگهداري يا حذف بافت اهدا شده از دريافت كننده است. تحقق اين مزيت بستگي به تكثير يك يا چند توده سلولي در شرايط خارج بدني (in vitro) و يا درون بدني (in vivo) دارد. تكثير توده هاي سلولي به لطف روشهاي مهندسي بدون نياز به كشت سلولي خارج بدني صورت مي گيرد. بسياري از سيستمهاي كشت سلولي شامل تركيبات مشتق شده از حيوان و ساير آلاينده هاي شيميايي يا بيولوژيكي است. علاوه بر اين اگر سيستم حاوي سلولهاي دگرزا (allogenic) يا بيگانه را باشد انتقال عوامل اكتسابي ممكن مي شود. هم بيمار و هم كاركنان آزمايشگاه بايد در قبال عوامل بيماري زاي احتمالي محافظت شوند به منظور حصول اطمينان كافي از ايمني در درمان هاي مهندي بافت FDA استانداردهايي را كه عمدتاً از مراكز تحقيقاتي و ارزيابي بيولوژيكي (CBER) به دست آمده است. را اعمال مي‌كند. اين استانداردها شامل موارد ذيل بوده اما تنها به آنها محدود نمي شود اين موارد عبارتند از: اجزاء محيط، به دست آوردن بافت، ذخيره سازي و به كارگيري كاشتني و سنجش ايمني محصول نهائي.

-اجزاء محيط:                                                                             MEDIA COMPONENTS

يك محيط كشت سلولي سنتي شامل مخلوطي از مواد غذايي ضروري (نمك ها، آمينواسيدها، ويتامين ها، كربوهيدرات ها، اسيدهاي چرب)، بافرها، (تثبيت كننده ها) و عناصر رديابي مي باشد كه با عوامل ميتوژنيك مشتق شده از حيوان، هورمون هاي مصنوعي، يا فاكتورهاي رشد باز تركيبي تكميل مي گردد. انواع خاص سلول ها نيز جهت تكثير نياز.مند كشت همزمان با سلولهاي تغذيه كننده هستند. كشت سلولي سنتي با سركوب همزمان سلولهاي ديگر بافت اصلي سبب تحريك رشد انتخابي انواع سلولهاي هدف مي گردد. اما به دليل اينكه درمان هاي مهندسي بافت مي تواند در برگيرنده چنيدين نوع سلول باشد براي تكثير انتخابي سلولهاي كشت شده يا خوابانيدن ساختارهايي كه شامل انواع سلولها هستند محيطهاي متعددي را مي توان مورد استفاده قرار داد. در نتيجه آماده سازي مواد مهندسي بافت مي تواند شامل ارتباط اجزاء آنها با محيط هايي داراي فرمولاسيون هاي مختلف باشد. هر محيط فرمولاسيون منحصر به فردي از مواد غذايي ضروري و مكمل خود را داشته كه بايد به طور جداگانه‏اي مورد ملاحظه قرار گيرد و جهت ايمني بيمار كه در معرض مستقيم قرارداد به صورت تركيب با ديگر فرمولاسيون‏ها در نظر گرفته ‏شود. مواد غذايي ضروري مي توانند حامل آلاينده‏هاي شيميايي باشند كه در حين فرايند پالايش زوده نشده اند سلولهاي مكمل يا تغذيه كننده مي توانند شامل آلاينده هاي بيولوژيكي باشند كه سبب عفونت شده و يا از رشد سلولها براي كاشتني نهايي جلوگيري مي كنند.

هرگونه تماس با تركيبات مشتقات حيواني يا انساني ممكن است سبب انتقال ژن هاي ايمني دگرزا يا بيگانه زا به دريافت كننده گردد به طور كلي هر تركيب از هر محيطي را مي‏توان توسط گواهي تجزيه و تحليل شناسائي نمود. اين گواهي تركيبات شيميايي و آزمون هاي بيولوژيكي را كه براي عوامل بيماري زا به وسيله FDA وضع شده است. توصيف مي‌كند. گواهي تجزيه و تحليل از طريق سازندگان اغلب محيط هاي تجاري در دسترس قرار داده مي شوند. به طور ايده آل، كليه محيط هاي به كار رفته در ساخت كاشتنيهاي مهندسي بافت بايد براي تعيين تركيباتشان داراي درجه خلوص در سطح دارويي باشند. متأسفانه تعريف اين سطح بيوشيميايي هنوز براي بسياري از سلولهايي كه در شرايط خارج بندي جهت پيوند رشد داده مي شوند به دست نيامده است. با وجود اين اهميت پالايش بيوشيميايي در محيط كشت سلولي شناخته شده و به طور وسيعي براي بيش از دو دهه مورد مطالعه قرار گرفته است. در نتيجه تاكنون نمونه هاي بسياري از محيط هاي بيوشيميايي براي كشت تركيبي و يا انتخابي سلولهاي انسان تعريف شده است. اصول پايه ريزي شده توسط اين موارد بايد به وسيله محققان و توسعه دهندگان كاشتني هاي مهندسي بافت اعمال شود تا استعمال تركيبات مشتقات حيواني يا انساني در كشت سلولي كاهش يافته يا حذف گرديد. درجه داروي محيط ها براي محصولات پزشكي مهندسي بافت يك هدف قابل دسيابي بوده و در دسترس بودن چنين محصولاتي احتمال ايمني بيماران را افزايش مي دهد. البته محيطهاي از اين نوع ممكن است هزينه قابل ملاحظه اي را به ساخت كاشتني هاي مهندسي بافت بيافزايند.

-اكتساب بافت                                                                              TISSUE ACQUISITION

تنوع و انعطاف پذيري روشهاي مهندسي بافت امكان افزودن سلولهاي اتولوگ(خودي)، آلوژنيك (دگرزا) يا زنوژينك (بيگانه زا) را به كاشتنيهاي ساخته شده فراهم نموده است. نكات ايمني دريافت كننده سلولهاي اتولوگ خودي به طور عمومي به دريافت عوامل اكتسابي(ميكروبي، ويروسي، عفوني) در آزمايشگاه محدود مي‌شود. البته تلفيق سلولهاي دگرزا يا بيگانه زا از امكان انتقال عوامل بيماري زا را اهدا كننده هاي غير اتولوگ فراهم مي‌كند. براي بافت هاي الوژيك، استانداردهاي ايمني جهت نگهداري متداول بافتهاي انساني با عصاره هاي بافت مقرر شده است. اين استانداردها مشابه بانك خون بوده و نيازمند بررسي اهدا كننده ها از جنبه هاي مختلف بيماري زايي است. كه از آن جمله مي‏توان ويروس ضد ايمني انسان (HIV) و انواع هپاتيت B و C را نام برد.

در فرآيند هاي ساخت دستگاههاي مهندسي بافت تعيين وضعيت مساعد اهدا كننده نيازمند تلفيق آزمون هاي بيماري زايي با فرايند هاي بهتر آزمون هاي ساخت (GMPS) دارد. مشابه بانك هاي بافت چه بافتها براي كاشتن به كاربرده شوند، و چه طرد شوند، به مهندسان بافت جهت ثبت و رديابي تاريخچه بافتها از زمان اهدا شدن در خلال فرآيند تا نگهداري و تنظيم نهايي نياز خواهد بود.

چنانچه بافت اهدا شده براي بررسي بيماري زايي فرا خوانده شود مسئوليت آگاهي دادن به پزشكي كه وظيفه كاشتن بافت توزيع شده را دارد بر عهده توزيع كننده بافت خواهد بود. مهندسان بافت تا زماني كه كاشتني هاي مهندسي بافت حاوي اجزاء باشند، به عنوان صاحبان بانك بافت قلمداد شده و همان مسئوليت را بر عهده خواهند داشت. همچنين شرايط آزمون در صورتيكه بافت از فرد فوت شده يا اهداء كننده زنده بدست آمده باشد متفاوت خواهد بود. در پايان تستهاي تبديل بافت تا چندين ماه پس از اهداء مورد نياز است. تا زمان تعيين ايمني نهايي، بافت ها يا سلولها در قرنطينه و اغلب در يخچالها يا شرايط سرد نگهداري مي شوند. قرنطينه بافت هاي بدست آمده از افراد فوت شده نيز قبل از عرضه جهت پيوند توسط بانك هاي بافت انجام مي پذيرد. بنابراين مهندسان بافت كه با سلولهاي آرلوژنيك سرو كار دارند ممكن است از قوانين ايمني بانكهاي بافت به عنوان يك مرجع جامع بهره مند گردند. در حقيقت تمامي قوانين وابسته به FDA در مورد كسب ايمني و پردازش بافت هاي انسان تحت عنوان استانداردهاي بانكداري بافت از انجمن آمريكايي بانك هاي بافت بيان مي شود.

بدست آوردن بافت هاي آلوژنيك نيازمند ارائه وجه مناسبي از كاربردهاي هدفمند است هم شركتهاي مهندسي بافت و هم بانك هاي بافت وظيفه توزيع بافت ها و يا مشتقات بافت را به صورت تجارت انتفاعي يا غير انتفاعي بر عهده دارند. با وجود اينكه استانداردهاي ايمني و تاثير پذيري تحت نظارت دادرسي فدرال تنظيم مي شود اما اهداي بافت تحت نظارت دادرسي فدرال تنظيم مي گردد. بدليل اينكه اهداي اندام و بافت بر رضايت اهداء كننده يا خانواده وي احتياج دارد، فرم رضايت نامه بايد به وضوح هدف استفاده از بافت را نشان دهد. شفافيت اين موضوع بايد به حدي باشد كه مورد استفاده اي را كه بدست آوردن بافت با آن هدف صورت مي پذيرد كاملاً تصريح نمايد، پيوند مستقيم براي كاربردهاي درماني، بررسي هاي تحقيقاتي، با استفاده از بافت به عنوان منابع اصلي مواد جهت ساخت محصولي ديگر.

اخيراً استانداردهاي مشابهي براي استفاده ايمن از بافت هاي زنوژنيك توسط FDA پيشنهاد شده است. بدليل كاربرد بافت زنوژنيك در حفظ پتانسيل ذخائر عظيم بافت هاي معمولي از گونه هاي بسيار مختلف، يا بافت هاي حاصل از حيوانات با ژنهاي تغيير يافته، توسعه استانداردها در اين بخش بسيار درخور توجه است.

علاوه بر موضوعات ايمني مربوط به انتقال عوامل بيماري زا، ايمني زايي و پايداري بردارهاي ژن هاي تغيير يافته نيز بايد مورد ارزيابي قرار گيرند. همچنين اگر سلولهاي اصلاح شده از نظر ژنتيكي پيوند شده باشند، پاسخ مشخص دريافت كننده به فنو تيپ تغيير يافته سلول ها نيازمند مطالعه خواهد بود. توسعه يك چارچوب قانونمند كه احتمالات مختلف پيوند بافت هاي زنوژنيك با مشتقات آنها را در نظر بگيرد هنوز به صورت رقابتي بين مهندسان بافت و FDA باقي مانده است.

-ساخت و نگهداري كاشتي IMPLANT FABRICATION AND STORAGE

پس از بدست آوردن بافت ها و آزاد شدن آنها از قرنطينه، فرآيند مهندسي بافت آغاز مي‏شود با وجود تضمين هاي خاص در مورد عاري بودن بافت هاي آلوژنيك يا زنوژنيك از عوامل بيماري زا، بافت هاي گرفته شده از خود شخص معمولاً تحت آزمون بيماريهاي خوني مادرزادي قرار نمي گيرند. در نتيجه هر بافت انساني تست نشده را بايد آلوده به عوامل بيماري زاي مرگ آور فرض كرد.

بردارش بافت ها جهت كشت سلولي يا نگهداري مستقيم بايد همراه با ايمني كاركنان آزمايشگاه باشد. اين استانداردهاي ايمني مهندسي بافت مي توانند از طرف سياستهاي بازدارنده بيمارستان در برابر بيماريهاي خوني مادرزادي تصويب شود. بطور كلي اين شيوه هاي اعمال شده براي حفاظت كاركنان شامل دستكش ها، لباس هاي ايمني و روشهاي بازدارنده سلولها يا بافت مي شود. عموماً اتاقك هاي ايمني بيولوژيكي كلاس II براي جلوگيري از فرآيند هاي كشت سلولي قابل قبول هستند. مسئله ديگري كه بايد لحاظ شود حفاظت از محيطهاي غذايي با استفاده از ظرفهاي كشت باز (براي مثال ظرف پتوي) يا ظروف غير قابل نفوذ (مانند بطري هاي غلتان و فلاسك هاي با درپوش صافي) است كه خطر قرار گرفتن محيطها را در تماس با سلولهاي انساني تست نشده به حداقل مي رساند.

-آزمون ايمني محصول نهائي از نظر سترون شدگي، سميت و ميكوپلاسها

SAFETY TESTING OF THE FINAL PRODUCT FOR STERILITY, ENDOTOXIN, AND MYCOPLASMA

كاشتني هاي مهندسي بافت بايد از نظر آلاينده هاي بيولوژيكي ايجاد شده در خلال پردازش براي بيماران كاملاً ايمن باشند. اين تضمين به وسيله آزمون سترون شدگي، سميت و ميكوپلاسما، در محصول نهائي قبل از آزاد سازي محصول انجام مي‌شود. سترون شدگي يك كاشتني كه شامل سلولهاي زنده مي باشد ممكن است نيازمند آزمون هاي سترون شدگي قبل از آزادسازي و در زمان پيوند زدن باشد. آزمون ها سترون شدگي را مي تواند در محيط تيوگليكولات (thioglycollate) و يا محيطهاي قابل قبول ديگر براي تشخيص ميكروارگانيزم ها انجام داد.

تعيين سميت توسط آزمايش ليمولوس آموبوسيت ليسات (LAL) انجام مي گيرد. ميكوپلاسماها جزء خانواده انگلهاي درون سلولي هستند كه بعضي از آنها مي توانند براي انسان بيماري زا باشند. شناسائي قارچ توسط كشت مستقيم در محيط كشت سلول نگهبان به وسيله پيوند (هيبريداسيون) در محل (in sifu) يا به وسيله آزمايش واكنش زنجيره پليمري (PCR) انجام مي گيرد.

اجزاي آزمايشات سترون شدگي نسبتاً ساده و ارزان است. البته آزمونهاي مربوط به مواد سمي و قارچ ها پيچيده و گران هستند. در نتيجه انجام هر آزموني در هر مرحله از آماده سازي كاشتني مهندسي بافت مي تواند به لحاظ اقتصادي امكان پذير نباشد. در عوض توسعه الگوريتم نمونه برداري جهت كنترل روند آماده سازي كاشتني هاي متعدد مي‏تواند جوابگو باشد. طرح ويژه الگوريتم آزمون غالباً براي قراردادهاي ساخت در مورد هر كدام از انواع كاشتني مهندسي بافت منحصر به فرد است.

-ملاحظات تأثيرپذيري                          EFFECTIVENESS CONSIDERATION

تعيين تأثيرپذيري تجهيزات مهندسي بافت بايد شامل تشخيص و اندازه گيري نكات خاصي باشد كه نشان گر تغييري سودمند در شرايط بيماري هستند البته همه درمانهايي كه به عنوان مهندسي بافت شناخته شده اند نياز به داده هاي مؤثر قبل از شروع بازاريابي ندارند. تمايز بين شرايط تأثير بيولوژيكي و تجهيزات بعداً در مبحث استاندادهايFDA مربوط به خطرات و تركيبات گفته مي‌شود براي طرح هايي كه نياز به آزمون هاي تأثير پذيري دارند اشكال سنتي ارزيابي مناسبند.

آزمون پيش باليني شامل شناسائي خارج بدني تركيبات است. (يعني آناتومي و فيزيولوژي) مطالعات حيواني، واكنش ميزبان به كاشتني ها، تغييرات جنبشي كاشتني و ترميم ساختار و عملكرد بافت آسيب ديده را مشخص مي كند. البته تجهيزات مهندسي بافت نيازمند ارزيابي هاي متفاوت از آنهائي است كه براي كاشتني هاي غير زنده به كار مي روند. كاشتني هاي غبر زنده و غير قابل جذب (مانند لگن فلزي پا مفاصل زانو، پيوندهاي عروقي از جنس تفلون) تمايل دارند به طور نامحدود و به صورت فصل مشترك با بافت هاي ميزبان باقي بمانند. تأثير كاشتني هاي از اين نوع معمولاً سريع، پايدار و با دوام است. در مقام مقايسه، اكثر كاشتني هاي مهندسي بافت شامل يك جزء قابل جذب و يك جزء سلولي هستند. با وجود استانداردهاي كامل و جامع در صورت شكست پليمرهاي غير سلولي تخريب پذير (براي مثال، پلي لاكتيك اسيد) و افزودن سلولها به پليمر هاي تصويب شده يا نشده توسط FDA ممكن است نيازمند هر دو ارزيابي باليني و پيش باليني باشد.

كاشتني هاي مهندسي بافت كه شامل سلول هستند مي توانند پردازش هاي آنابوليك يا مصنوعي را در سلولهاي پيونده زده شده يا بافت هاي ميزبان تحريك كنند. پردازش هاي مصنوعي در كاشتني هاي مهندسي بافت همچنين جهت تعيين نرخ و ميزان تأثيرات درماني ممكن است نياز به ارزيابي قبل يا بعد از پيوند زدن داشته باشند.

- ارزيابي پيش باليني                                             CLINIVAL ASSESSMENT

تجهيزات مهندسي بافت در زمان ساخت و قبل از پيوند زدن نياز به آزمون بيمه كيفيت (QA) دارند تا تضمين كند كه خصوصيات طراحي با تركيب مطابقت دارد.

اين مشخصه ها با آناتومي و فيزيولوژي بافت هدف قابل مقايسه هستند. به دليل اينكه مهندسي بافت هنوز نسبتاً در مراحل اوليه خود به سر مي برد آناتومي و فيزيولوژي كاشتي ساخته شده در اغلب موارد زير مجموعه اي از بافت آسيب نديده در نظر گرفته خواهد شد. اگر كاشتني شامل سلولهاي زنده باشد، آزمون زيست پذيري (Viability) به عنوان شاخص پيش گويي قابليت دستگاه براي اصلاح آناتومي و فيزيولوژي بعد از پيوند توصيه مي‌شود. تا زماني كه دستگاههاي محققين مختلف جهت ترميم بافت مشابه (مثلاً استخوان) به كار گرفته ميشود استانداردهاي QA براي كليه دستگاهها بايد از استاندارد مقايسه اي استخوان آسيب نديده استفاده كنند. توسط اين فرايند يك دستگاه ممكن است قابليت اندازه گيري افزايش استحكام استخوان را تا 70% , 50% , 30% و … را در شرايط خارج بدني دارا باشد. چنين سنجشهايي احتمالاً ميزان تأثير را در زمان پيوند و نرخي را كه در آن عملكرد مي تواند بهبود يابد پيش بيني مي كنند.

پيش بيني تأثير گذاري معمولاً به مطالعات حيواني به عنوان قمستي از ارزيابي پيش باليني محتاج است. در اين مطالعات نتياج نهائي تجهيزات مهندسي بافت مي‏تواند مستقيماً با سنجش هاي متعارف نتايج باليني سازگار شود با سازگار كردن نتايج نهائي موجود در مدل هاي حيواني مي توان تجهيزات مهندسي بافت را مستقيماً براي كاشت بافت هاي خود شخص يا بافت هاي مشابه هموژن (ايزوژنيك) به جاي كاشتني هاي جذب نشدني و غير زنده استفاده كرد. نتايج اين مطالعات پيش باليني مي تواند داده هايي را جهت توجيه ابتدايي تحقيقات باليني فراهم كند. بدون اجراي مطالعات پيش باليني موفق، انتظار مي رود كه احتمال موفقيت تحقيقات باليني نيز كاهش يابد.

-ارزيابي باليني                                                                          CLINICAL ASSESMENT

تقريباً تمامي تجهيزات مهندسي بافت قبل از كسب مجوز بازاريابي توسط FDA نياز به اثبات تاثير گذاري باليني دارند. اگر چه درمانهاي تحقيقاتي با مهندسي بافت مي تواند بسيار متنوع و پيچيده باشند اما طرح هاي تحقيقاتي براي سنجش تاثير گذاري چنين نيستند. مقايسه يك دستگاه تحقيقاتي با استاندارد رايج درمان به عنوان كنترل مثبت يا با درمان شبه دارويي به عنوان كنترل منفي يك ارزيابي بسيار معتبر را فراهم مي كند البته برخلاف داروها، به حساب آوردن دستگاههاي شبه دارو در طرح تحقيقاتي بسيار مشكل تر است. بنابراين مقايسه كردن با استاندارد رايج درمان اساس ارزيابي كاشتين هاي مهندسي بافت را پايه ريزي مي كند. با توجه به كاربرد مطلوب و هدف پزشكي كه دستگاه بخاطر آن طراحي شده است نكات اصلي براي تعيين تاثير گذاري باليني از تشخيص معمولي، درمان و پيش بيني هدف بدست مي آيد. همچنين، با توجه به بيماري تحت معالجه، مي توان درمان تحقيقاتي را بصورت طرح بيماران جفت – جفت يا به شكل تصادفي از ميان جمعيت بيماران تحت مطالعه مورد مقايسه قرارداد. بطور كلي ميزان تاثير پذيري با كاهش سمپتوم باليني يا بهبود عملكرد فيزيولوژيكي قابل محاسبه است. اگر مهندسان بافت نكاتي خارج از مصوبه هاي استانداردهاي مراقبت باليني براي تاثير گذاري باليني طراحي يا انتخاب كنند، فرايند ارزيابي بخاطر شرايط مورد نياز براي قانونمند كردن نكات اصلي مربوطه طولاني مي‌شود.

در اكثر نمونه ها، فرايند تحقيق باليني براي تجهيزات مهندسي بافت با تجهيزات غير جذب شونده و غير زنده متمايز نيست. مطالعات انجام گرفته تحت معافيت تحقيقاتي دستگاه (IDE) صورت گرفته و فازهاي سنتي (I,II,III) را براي جمع آوري داده ها قبل ازصدور موافقت نامه پيش بازاريابي (PMA) دنبال مي كند. البته موافقت نامه بازاريابي براي يك دستگاه پزشكي را مي توان از طريق قرار داد توسعه محصول (PDP) نيز بدست آورد كه شامل مكانيزم تشريح بهسازي تجهيزات پرشكي سال 1976 مي‌شود. درمانهاي مهندسي بافت كه حاوي مواد بيولوژيكي هستند ممكن است به گواهينامه كاربرد بيولوژيكي FDA (BLA) يا مصوبه ساخت قبل از شروع بازاريابي نياز داشته باشند.

-فعاليت هاي قانون مند              REGVLATORY ACTIVIES OF FDA

درمان هاي تحقيقاتي مهندسي بافت، نمايشي منحصر به فرد از رقابت سازمان FDA، مركز تجهيزات سلامتي و راديولوژي (CDRH)، مركز تحقيقات و ارزيابي بيولوژيكي (CBER) و مركز تحقيقات و ارزيابي دارو (CDER) است. شايد بتوان گفت كه اكثريت كاشتني هاي مهندسي بافت را سلول هايي تشكيل مي دهند كه تاريخچه بيشتر آنها توسط CBER بررسي شده است، اين كاشتني ها همچنين شامل پليمرهاي پالايش شده‏اي هستند كه اغلب توسط CBER بازنگري شده اند. از آنجا كه مهندسي بافت مي تواند مباحث رهايش دارو و يا سنتز دارو توسط روش هاي تغيير ژن را نيز در بر گيرد، بافت هاي مهندسي خاص نيز ممكن است به بازنگري توسط CBER نياز داشته باشند. اين رقابت هاي جديد بصورت خيلي پويشگرايانه توسط FDA در خلال گفتگوهاي انجام شده با افراد مجرب و عموم مردم مورد ملاحظه قرار گرفته است، همچنين به توسعه مكانيزم هاي بين مركزي جهت تسهيل بازنگري درمان هاي تركيبي توجه شده است. اين مقدمات به طرح و پايه ريزي قوانين و سياست هاي جديد تعيين ايمني و تاثير درمان هاي تركيبي منتج شده است.

در طول سال هاي 1990 تلاش هاي قابل ملاحظه FDA سبب توسعه پايه علمي شد كه كليه نمايندگي ها به آن مراجعه كرده و با ايجاد يك اتفاق نظر همگاني، كليه شركت كنندگان از آن سود مي برند.

-طبقه بندي سنتي تحت عناوين تجهيزات، مواد بيولوژيكي يا داروها

TRADITIONAL CLASSFICATIONS AS DEVICES, BIOLOGICS, OR DRUGS

لايحه فدرال غذا، دارو و لوازم آرايشي سال 1938 اختياراتي را براي قانون مندي غذا، دارو لوازم آرايش، تجهيزات و داروهاي حيوانات جهت ايمني آنها وضع كرد. بهسازي تجهيزات پزشكي سال 1976 و لايحه تجهيزات پزشكي ايمن سال 1990 كلمه «دستگاه» را براي طبقه بندي كليه تجهيزات پزشكي، وضع حق صلاحيت صفحات مشورتي، جلوگيري از تقلب و چسباندن مارك هاي نادرست و نياز به پيروي از اصول درست ساخت GMPS تعريف كرد. اجراي اين اختيارات وسيع توسط FDA گاهاً به بازنگري IDE كه نيازمند تكميل و استخدام كادر متقاضيان صنعتي در اوضاع نامساعد رقابتي بود منتج مي شد. كنگره در سال 1977 با تصويب لايحه نوين سازي FDA (35) به اين مشكلات پاسخ داد كه در حال حاضر نيز اجرا مي شوند. تصويب اين قانون سبب محدود كردن زمان پاسخ گويي FDA به درخواست هاي تحقيقاتي و در نتيجه پاسخ محققان به سوالات FDA شد. علاوه بر اين وجود تعهدات FDA نسبت به سرمايه گذاري هاي كنگره به شدت زمان بازنگري درمان تحقيقاتي و بررسي سفارشات معوقه را كاهش داد.

CBER در دهه گذشته سهم به سزايي در توسعه استانداردهاي پيشرو در مورد كاشتني هاي مهندسي بافت داشته است خلاصه مقدمات CBER تحت طرح فعاليت بافت در آدرس

كه شامل قوانين و توسعه سياست، توسعه اسناد راهنما، بررسي ها و مصوبات، و هماهنگي سياست ها قانون مند و علمي است آورده شده است. يكي از فراگيرترين جنبه هاي اين طرح، توسعه اي تحت عنوان روش پيشنهادي براي قانون مند كردن محصولات پايه سلولي و بافتي (21)

است (جدول 1-1 و 2-1) . در حال حاضر اين ساختار كاملاً به اجرا درنيامده است اما موضوعات بنيادي مثل انتقال بيماري هاي مسري، كنترل هاي پردازش، ايمني باليني و تاثير گذاري، ارتقاء و بر چسب گذاري، مانيتور كردن و مطالعه، سلول هاي ساقه و استخوان كافن زدايي شده مورد ملاحظه قرار گرفته اند. اخيراً موضوع فركاشت ميزبان توسط CBER مورد توجه قرار گرفته است.

CBER در دسامبر 1999 پيش نويس راهنمايي را براي صنايع منتشر كرد كه درآن خطرات انتقال زونوسيس (عوامل بيماري زاي حيواني) توسط فراكاشت ميزبان مورد آزمايش قرار گرفته بود. اين اسناد همچنين خطرات مستقيم دريافت كننده زونويس و خطرات غير مستقيم انتقال بعدي ناشي از تماس نزديك (براي مثال، همسر) شخص دريافت كننده فرا كاشت را بيان مي كند. اين پيش نويس شرح مي دهد كه شخص دريافت كننده كاشتني و نزديكان وي بايد از اهداي خون و بافت جلوگيري كنند تا احتمال انتقال بيماري محدود شود. اين مطالب، بخش بسيار كوچكي از ملاحظات گسترده اي را نشان مي دهد كه در حال حاضر مورد بحث FDA قرار دارند.CBER و CDRH با هم اكثريت غالب مطالب مربوط به محصولات مهندسي بافت را مورد توجه قرار داده اند.

پردازش هاي كنترل تركيبات محصول نهايي جهت اطمينان از ايمني كاشتني هاي مهندسي بافت ضروري است. براي ايجاد چنين اطميناني، FDA نيازمند همكاري نزديك با GMPS است. اين شرايط براي حفاظت دريافت كننده و كاركنان آزمايشگاه كه قبلاً مورد بحث قرار گرفت و همچنين حفظ و نگهداري ركوردهاي جامع فرايندهاي پردازشي فراهم شده است. در مورد تجهيزات، در هنگام شروع بازاريابي روند ساخت GMP مورد نياز خواهد بود، اما توصيه مي‌شود كه اين بخش در فاز III (چند مركز) سطح تحقيقاتي قبل از بازاريابي صورت گيرد. از نظر تاريخي، استانداردهاي GMP بخاطر در نظر نگرفتن پردازش بافت به عنوان يك فرايند ساخت در مورد بافت هاي نگهداري شده در بانك اعمال نمي شود. البته، در حال حاضر آزمون هاي بهينه بافت (GTPs) توسعه يافته و براي بدست آوردن و استعمال بافت ها جهت كاشتن (36،4) بكارگرفته مي شوند. GTPs از هر منبع بيولوژيكي جهت استعمال بافت ها استفاده مي كند.

-شرايط (مقتضيات) قانون مندي متناسب با خطر و تركيبات

REGULATORY REQVIREMENTS DEPENDENT ON RISIC AND COMPOSITION

همانطور كه پيشتر گفته شد، كاشتني هاي مهندسي بافت عمدتاً بصورت دستگاه و مواد بيولوژيكي هستند. در اغلب موارد، سلولهاي اندامي با پليمرهاي تركيب شده و يا سلول غير اندامي به تنهايي يا به همراه پليمرها به عنوان دستگاههاي كلاس II (داراي خطر قابل ملاحظه اي هستند) كه نيازمند اثبات اثر گذاري هستند شناخته مي شوند. البته سلول هاي اندامي به تنهايي يا يك ماتريس بافت سلولي نيازي به داشتن مجموعه اي از داده هاي مبتني بر اثر گذاري ندارد.

سلولهاي زنده اندامي كه بصورت خارج بدن (exvivo) ساخته مي شوند و هدف ترميم ساختارها را دنبال مي كنند نيازي به اثبات تاثير پذيري در حال حاضر ندارند. سلول هايي از اين نوع مي توانند شامل كراتينو سايت ها و كندرو سايت هاي اندامي كشت يافته و مغز استخوان پردازش شده باشند. علاوه بر اين، تنظيم انبوهي (جمعيت) سلولهاي اندامي بسيار مشابه بافت‏هاي نگهداري شده در بانك است كه به دليل داشتن اثر گذاري ذاتي، نيازي به مطالعات اثر گذاري ندارند. طبقه بندي هاي كم خطر مشابه از اين نوع به ماتريس هاي سلولي مشتق شده از بافت انساني اطلاق مي شوند. در نتيجه اگر هيچ گوه داده اي مبتني بر تاثير گذاري جمع آوري نشده باشد، هيچ نوع ادعايي درمورد تاثير گذاري در تبليغات و يا برچسب ها نيز نمي توان داشت.

 

 

ساروين كارميول

اين فصل دو مقوله: گزينش (Selection) و جداسازي(Isolation) سلول را در بر ميگيرد. تقسيم بندي فوق از نظر اولويت صورت گرفته است. براي كسب بهينه ترين نتيجه، بهتر است كه ايزولاسيون و گزينش به طور همزمان صورت گيرد. بغير از سلول‏هاي سيستم خون سازي و بافت‏هاي جنيني خاص سلول‏هاي معمولي ديگر ذاتاً به ماتريس‏هاي خارج سلولي مرتبط مي شوند. شيوه‏هاي متفاوت پاره كردن (گسيختن) ماتريس‏ها نه تنها بر كارائي گوراش آنزيمي بلكه بر جمعيت سلولي تأثير مي گذارد. همچنين سيستم كشت سلولي كه شامل ماده بازال (بنيادي) و مكمل‏ها است نه تنها با فراهم كردن مواد غذايي و شرايط مناسب بر بقاي سول‏ها تأثير مي گذارد بلكه مي تواند يك پتانسيل گزينشي قابل ملاحظه را در ترجيح يك نوع سلول بر ديگري اعمال كند.

نوشته‏هاي فراواني درمورد موضوعات اين فصل وجود دارد. ايزولاسيون و پاك سازي سلول‏ها يك فرايند پيچيده است و يكي از اهداف اين فصل كمك به آسان نمودن اين پيچيدگي است. براي كسب اطلاعات مفصل در مورد جنبه‏هاي گوناگون كشت سلولي لطفاً به نوشته‏هاي فرشني اشتودزينسكي و مسترز مراجعه كنيد.

- ايزولاسيون سلول                                                    CELL ISOLATION   

تحقيقات به خوبي نشان مي دهد كه انواع سلول‏هاي مشابه مانند سلول‏هاي فيبروبلاست، اندوتليال يا پري اديپوسايت‏ها در محل‏هاي آناتومي مختلف داراي مشخصه‏هاي متفاوت هستند. اما اين موضوع كه چگونه سلولهاي آناتومي يك محل نيز مشخصه‏هاي متفاوت از خود نشان مي دهند هنوز به خوبي شناخته شده نيست. ناهمگني سلولي (هيتروژنيتي) در اثر خصوصيات ويژه آنها رخ مي دهد. اين خصوصيات مي تواند يكي از پارامترهاي عملياتي جمعيت سلولي باشد. پديده فوق با اين تصور كه خصيصه‏ها لزوماً در داخل جمعيت سلولي داراي توزيع همگن (هموژن) نيستند قابل توجيه است. فيبروبلاست‏ها جمعيتي هستند كه در داخل محل آناتومي از خود خصوصيات فنوتيپيكي متفاوت نشان مي دهند، مطالعات فرايز و همكارانش همچنين لكيك و همكارانش را بر روي موش، ريه انسان، لثه (پيرادنداني) و هتروژنيتي (ناهمگن) فيبروبلاست لثوي ملاحظه كنيد. همچنين مشاهده شده است كه فيبروبلاست‏ها عكس العمل‏هاي متفاوتي به تحريكات كلاژن‏هاي آزاد شده توسط تومور يا سلول‏هاي قليا خواه (mast cells) نشان مي دهند. علاوه بر اين فنوتيپ‏هاي مختلف سلول‏هاي اندوتليال عروق كوچك در كورپوس لوتئوم (جسم زرد گاو) (luteum bovine corpus) با در نظر گرفتن اكتين، سايتوكراتين و ويمنتين حساس به گاما، اينترفرون (IFN- ) نشان دهنده هتروژينتي است. منطقي است اگر كل جمعيت سلولها را با توجه به خصيصه‏هايشان در هتروژنيتي (ناهمگن) دخيل بدانيم. هدف سنتي از انجام كشت سلول‏هاي اوليه تهيه مقدار كافي از سلول‏هاي قابل رشد واجد شرايط مي باشد كه تضمين كننده شباهت توزيع نهايي سلول‏ها با توزيع يافته شده در بافت اصلي است. استفاده از كشت سلولي به عنوان مدلي براي شرايط داخلي بدني (in vivo) تا حد.ود زيادي به الزامات زير نيازمند است. چندين فاكتور مؤثر بر نتيجه عبارتند از: محل آناتومي، پاتولوژي (آسيب شناسي)، نرمالسي (normalsy) يا درجه ايسكمي (كم خوني) ميزان فراواني بافت به كار رفته بر اين فاكتور‏ها تأثير مي گذارد. طبيعت متنوع معماري بافت به روش‏هاي مختلفي براي توزيع سلول نيازمند است. براي مثال استخوان، مغز، ماهيچه‏هاي اسكلتي كبد و طحال داراي پيوندهاي ماتريس سلول- سلول و سلول- برون سلولي هستند. نتيجه اين شرايط اين است كه هيچ قراردادي همه انواع بافت را پوشش نمي دهد. در مورد نحوه ايجاد كشت اوليه و تجزيه بافت مطالب چندي منتشر شده است كه تلاش در بهينه سازي اين موضوعات براي سلول نتيجه بخش خواهد بود.

-توضيح

استراتژي‏هاي مختلفي براي ايزولاسيون سلول‏هاي موجود در بافت‏هاي سخت وجود دارد از جمله: روشهاي برون كاشت (explantation) آنزيمي، مكانيكي و تجزيه شيميايي، (chemical disaggregation) تزريقي (perfusion) يا تركيبي از آنها. يكي از جديد ترين شيوه‏ها در جداسازي سلول و تكثير سلول‏ها در داخل آزمايشگاه (in vitro) برون كاشت قطعه‏هاي بافت است. در اين روش تا زماني كه انتشار مواد غذايي و گازها محدود نشود بافت به قطعات بسيار كوچك خرد ميشود. اين عمل با بريدن و كوچك سازي بافت مورد نظر تا اندازه اي مناسب صورت مي گيرد. سپس قطعات باف در ظروف كشت بافت كه با سرم جنيني گاو (fetal bovine serum) يا ماتريس‏هاي ديگر پوشيده شده است قرار داده مي شود. تركيب ماده و پوشش سطح همان طور كه در ايزولاسيون انواع سلول از گلومرول‏ها (glomerulus) نشان داده شده است، مي تواند اثر قابل توجهي بر نوع سلول نهايي توليد شده داشته باشد. همچنين مي توان قطعات بافت را براي تثبيت اتصال در زير پوشش قرار داد زيرا تماس مستقيم با سطح كشت بافت براي كشت موفق برون كاشتني (explant) ضروري است.

عموماً براي قرار دادن بافت در محيط كشت از دستگاههاي مكانيكي استفاده شده و هيچ گونه آنزيمي اضافه نمي گردد. كشت اوليه توسط روش برون كاشت نسبت به ديگر روشها زمان بيشتري را طلب مي‌كند، اما روش برون كاشت به خاطر استفاده از خاصيت حساسيت پتانسيلي سلول مورد نظر به تركيب آنزيم داراي مزاياي بيشتري است. اگر آنزيم قابل ارائه در محيط باشد مي توان بافت را با غلظت آنزيمي بهينه براي مدت كوتاهي در دماي اتاق و يا براي مدت طولاني تري در دماي c⁰ 4 نگهداري كرد. در اينجا هدف، تجزيه بافت نيست بلكه سازگار كردن مناسب ماتريس برون سلولي جهت حركت مؤثر سلول مورد نظر است.

دليل انتخاب روش برون كاشت، حفظ سطح غشاء عملياتي است. همچنين در مواردي كه نمونه بافت موجود كوچك باشد روش جداسازي آنزيمي با مكانيكي بسيار مخرب بوده و سلول‏هاي فراواني از دست مي روند كه ادامه كار را غير ممكن مي سازد. تأثير آنزيم‏هاي پروتئوليتيك بر اجزا سطح سلول شناخته شده است، به طور مثال، ايموگلوبولين سطح (Ig) در اثر پروناز و كيموتريپسين به سرعت از لنفوسيت‏هاي B جدا شده ولي در اثر تريپسين و پاپائين اين عمل كندتر انجام مي شود و توسط كولاژن‏ها اصلاً صورت نمي گيرد. همچنين تريپسين در مقايسه با كلاژن فسفوليپيدها و اسيدهاي چرب راديواكتيو بيشتري را از غشاء اندوتليال سلول آزاد مي‌كند.

كشت اوليه برون كاشتي به قابليت حركت نوع سلول مورد نظر بستگي دارد از معايب اين روش بالاتر بودن پتانسيل رشد انواع سلول آلاينده نسبت به سلول مورد نظر و مشكل پيوستگي قطعات بافت است. از طرف ديگر اگر سلول مورد نظر پر تحرك ترين سلول باشد اين روش مي تواند تكنيك منتخب باشد.

يكي ديگر از موارد مورد توجه از بين رفتن مشخصه‏هاي فنوتيپيك سلول‏هاي به واسطه گوارش آنزيمي است. اگر سلول‏ها دقيقاً بعد از جداسازي مورد استفاده قرار گيرند، گوارش آنزيمي ضروري است. البته اگر هدف ايجاد يك جمعيت كشت سلولي آزمايشگاهي باشد شرايط اوليه سطح سلول از اهميت كمتري برخوردار خواهد بود. ساختارهاي غشائي با پارامتر تحمل وارونگي توصيف شده و براي يك جمعيت سالم سلولي مي توان فرض كرد كه ساختارهاي سطح قابل ترميم خواهند بود.

البته اين وضعيت براي هر نوع سلولي معتبر است.

- مكانيكي                                                                                                      MECHANICAL

روش‏هاي مكانيكي قطعه قطعه كردن بافت شامل روش گردابي، تكان دادن در شيكر چرخشي، پودر سازي با پيپت‏هايي با قطرهاي متفاوت، عبور بافت از ميان شبكه‏هاي نايلون و يا فولاد ضد زنگ و خرد كردن بافت با سوزن‏هاي نازك مي شود. اين فرايندها تعليق سلول را زودتر از گوارش آنزيمي ايجاد مي كنند، البته محدوديتهايي در اين مورد وجود دارد. اين روش‏ها به طور كلي براي همه بافتها مؤثر نيستند. تشخيص نوع روش بستگي به مقدار نيروي اعمال شده به بافت داشته كه اين جنبه مي تواند سبب آسيب شود. سلول‏ها به برش حساس بوده و آسيب جدي مي بينند. برش سلولهاي استوبلاست شكل MC3T3-E1 به دست آمده از جمجمه نوزاد موش سبب تغيير مورفولوژي ‍(شكل) و كاهش تدريجي كلسيم بين سلولي باقي مانده گرديد. همچنين رشد سلول‏هاي اندوتليال به واسطه تنش برشي تيغه اي متوقف شد. ادامه اين بحث در صفحات بعد آمده است. البته در مورد برخي از بافت‏هاي نرم از جمله طحال، تيموس، گره‏هاي لنفي كبد جنيني و تومورهاي نرم و احتمالاً مغز مي توان تجزيه مكانيكي را بدون آسيب سلولي اجرا كرد.

روش‏هاي مكانيكي در پاسخ به اثرات بالقوه زيان آور آنزيم‏ها درطول گوارش توسعه پيدا كردند. هنگامي كه شرايط ايزولاسيون مناسب براي وسايل مكانيكي مهيا باشد اين روش بر روش گوارش آنزيمي بخصوص بازسازي سلولي ارجعيت دارد. تحت اين شرايط كاهش معرف‏هايي مانند آنزيم‏ها وجود منابع، تأثيرات و هر گونه مطلب قانون مند ديگر را غير ضروري مي سازد. البته زماني كه روش‏هاي مكانيكي با گوارش آنزيم همراه شود مؤثر تر خواهد بود. لايه لايه كردن بافت با چاقوي جراحي براي كم كردن اندازه بافت و در نتيجه افزايش سطح منجر به ايزولاسيون مؤثر تر مي گردد.

-گوارش آنزيم                                                                             ENZYME DIGESTION

نوع آنزيم به كار رفته بر نتيجه گوارش تحت عناوين بازده، راندمان محصول، قابليت رشد و سميت تأثير مي گذارد. ايزولاسيون سلول‏ها از تومورهاي سخت با استفاده از تجزيه آنزيمي يا مكانيكي منجر به فراواني‏هاي متفاوت مي شود. در بافت ايزوله شده به روش آنزيمي، زير جمعيت آنوپوليد (aneuploid subpopulation) در مقايسه با بافت به دست آمده از تجزيه مكانيكي نمايان تر است. كه بيانگر آسيب پذيري متفاوت جمعيت‏هاي مختلف سلول‏هاي بافت در برابر تركيبات آنزيمي است. همچنين درمطالعات انجام شده بر فرايند جداسازي هپاتوسايت موش در هنگام استفاده از EDTA به جاي كولاژن محتويات سايتوكروم 450 P قابل شناسائي به روش طيفي و مدت دار و حفظ و نگهداري سيستم اكسيد از با كار كرد تركيبي به دست آمد. در مورد اين مشاهدات استثناهائي نيز وجود دارد: مطالعات نشان مي دهد كه سلول‏هاي توموري را مي توان با استفاده از گوارش آنزيم بسيار مؤثر تر از روش‏هاي مكانيكي جدا كرد . و اينكه كلاژن‏هاي ايزوله شده پيگ هپاتو سايت‏ها خيلي بيشتر از EDTA ايزوله شده هپاتوسايت‏ها زنده مي مانند. يك تفسير در مورد اين نتايج متنوع بر مبناي حساسيت نسبي سلول‏ها نسبت به آنزيم‏ها و تجزيه مكانيكي استوار است. تأثير بسياري از متغيرهاي غير قابل كنترل نيز (به طور مثال شرايط بافت) بر اين مشاهدات اضافه مي شود.

هپاتو سايت‏هاي ايزوله شده موش بالغ به وسيله تزريق تريپسين و كلاژن نشانگر خصوصيات متفاوت بود: هپاتو سايت‏هاي كلاژني داراي بازده چسبندگي دو برابر بوده و مدت طولاني تري در محيط كشت باقي مي ماندند، همچنين توليد آلبومين بيشتري داشته و فعاليت تيروسين آمينو ترانسفراز در آنها در مقايسه با هپاتو سايت‌هاي جدا شده توسط تريپسين بيشتر است. در جداسازي پروسين از جزاير لوزالمعده توسط گوارش با كلاژن، جزاير بزرگ به فعاليتهاي پائين تريپتيك و نتايج جداسازي ضعيف به فعاليت بالاي تريپتيك مرتبط مي شود. باز داشتن تريپسين توسط پفابلوك (Pefabloc) منجر به بهبود تكثير جداسازي در جزاير لوزالمعده مي شود. نكته جالب در مورد ايزولاسيون توسط گوراش با آنزيم خارجي نقشي است كه ترشح داخلي آنزيم‏هاي پروتئوليتيك به واسطه فرايند گوارش ايفا مي كند كه اين ترشح خاص بافت است. بافت‏هاي به دست آمده از اهدا كنندگان مختلف نسبت به گوارش آنزيم عكس العمل‏هاي متفاوتي نشان مي دهد. از ‎آن جا كه لوزالمعده محل سنتز تريپسين است بايد به جداسازي سلول‏هاي جزاير لوزالعمده توجه داشت تا امكان ايجاد فراگوارش وجود نداشته باشد.

امروزه مي دانيم كه تريپسين مي تواند به غشاء سطح آسيب وارد كند، اما ظاهراً نقش ذاتي تريپسين نيز در اين مورد دخالت دارد. مطالعه دمايي تريپسين در طول يك مسير متوالي نشان داد كه دماهاي زير c⁰ 15 زيست پذيري (viability) و تكثير را افزايش مي دهد اين وضعيت با تأثير دما بر پديده‏هاي ذاتي ديگر غشاء سازگاري مي دارد. اگر مشكل اصلي زيست پذيري باشد، استفاده از دماي پائين تر در طول گوارش پيشنهاد مي شود.

براي گوارش بافت، اغلب كلاژنهاي تجاري به دست آمده از كلستريديوم هيستوليتيكم مورد استفاده قرار مي گيرند. تغييرات درجه ناخالصي بازدهي و سميت توصيف كننده تركيبات خام هستند تركيبات خام تعريف نشده هستند و از كلاژنازهاي مختلف، پروتئاز‏ها، فسفوليپازها و باكتريهاي همراه با محصول مانند اندوتاكسين تشكيل مي شوند. با توجه به نبود يك تعريف مشخص براي تركيبات كلاژن‏ها، وجود تفاوت‏هاي قابل ملاحظه بين محصولات فروشندگان مختلف و حتي يك فروشنده ثابت دور از ذهن نيست. تلاش براي تصفيه تركيبات كلاژناز خام توسط بازده گوارش بافت احيا شده توصيف شده و نشان دهنده حضور پروتئاز‏هاي تصفيه شده كه يك استراتژي مؤثر است، جهت تأئيد عدم وجود اثرات زيانبخش بايد دقت لازم به عمل آيد. استفاده از سيستم‏هاي آنزيمي مشخص با افزايش تعداد محصولات درمان سلولي اهميت بيشتري پيدا مي‌كند. سازمان‏هاي قانونمند براي نيل به اهداف خود نيازمند شرح كامل اجزاء معرف‏هاي به كار رفته در تركيبات محصولات هستند. وجود اجزاء نامشخص مانند تركيبات آنزيم سبب ايجاد رقابت شديد ميگردد.

-تروما                                                                                                                               TRAUMA

بافت‏هاي بيرون آورده شده دچار ايسكمي مي شوند. مدل‏هاي ايسكمي بازتزريقي (Ischemia-reperfusion models) توسط واكنش‏هاي انفجار گونه اكسيژن (ROS) توصيف مي شوند. البته در اثر توليد سوپر اكسيد و پراكسيداسيون ليپيد در نبود باز تزريق نيز امكان صدمه ديدن وجود دارد يك اظهار نظر ظاهراً درست بيان مي‌كند كه در طول ايسكمي ميزان  كافي براي حفظ محصول سوپر اكسيد وجود دارد. اين گفته به نظر صحيح مي رسد زيرا به كار گيري ديسموتاز سوپر اكسيد (SOD) سيگنال ROS را تضعيف مي‌كند. اگر SOD به عنوان ضد اكسيد كننده اضافه شود بايد كاتالاز نيز اضافه گردد زيرا محصول ديسموتاسيون سوپراكسيد پراكسيد هيدورژن است كه به تنهايي قابليت آسيب رساني دارد. همچنين راديكالهاي آزاد تحت شرايط هيپوكسي در سلول‏هاي ماهيچه اي نرم شريان ريوي موش نشان داده شدند.

به كار گيري ضد اكسيده كننده‏هايي مانند ويتامين E ، ان- استيل- ال- سايستاين يا دي فنيلين يدوئيم نشان دهنده كاهش سطوح ROS و مرگ سلوهاي بعدي است. همچنين بازدارنده‏هاي پروتئاز مانند  ماكروگلوبولين و ضد اكسيد كننده‏هاي ان- استيلن- ال سايستاين تعداد سلول‏هاي آزمايشگاهي ژرم (germ cells) نخستين خوك را افزايش مي دهد. طولاني شدن و قرار گيري در معرض ROS منجر به مرگ بافت يا اپوپتوزيس مي گردد. قرار گرفتن در معرض شدت بالا به مدت طولاني مي تواند به مكانيزم اپوپتوتيك آسيب وارد كرده و مستقيماً منجر به مرگ بافت شود. فاكتورهاي رشد مانند فاكتور سلول استم(ساقه) و فاكتور باز دارنده سرطان خون (لوسمي) مي تواند جلوي اپوپتوزيس را گرفته و سبب بقاي سلول ژرم نخستين جنين موش شود.

هنگامي كه سلول‏هاي چسبنده از هم باز مي شوند حالت اپوپتوزيس يا به اصطلاح آنويكيس را مي گيرند. ROS نيز با تأثير گالكتين-3 بر آپوپتوزيس در اين شكل گيري سهيم است . افزودن اسيد بانگكركيك كه يك بازدارنده انتقال نفوذپذيري ميتوكندري است به طور قابل ملاحظه اي آنويكسيس استئوكلاست‏ها را همانند حضور
z -VAD-FMK كه يك بازدارنده كاسپيس است كاهش مي دهد در ايزولاسيون سلول جزاير پانكراس تركيبات (محتويات) مرتبط با ماتريس خارج سلولي براي مدت طولاني تري در محيط كشت زنده باقي مانده و در آزمون ترشح انسولين بهتر عمل مي كنند همچنين سلول‏هاي جنيني پانكراس با ملاحظه و رعايت موارد آپوپتوتيك و تغذيه اي از مرگ ايمن بوده وان- استيل- ال- سايستاين از اپتوزيس در سلول‏هاي جرم انساني در محيط آزمايشگاه جلوگيري مي كنند. ايزوله كردن برخي از انواع سلول‏ها مشكل است. فاكتورهاي زيادي در موفق بودن ايزولاسيون سلول و استقرار بعدي سيستم كاشت سلول دخيل هستند. ملاحظه تروماي سلول در بهتر شدن نتيجه نهايي تفكيك سلولي كمك مي‌كند.

-سنجش زيست پذيري (بقاسنجي)      MEASUREMENT OF VIABILITY

تغيير پذيري ذاتي عكس العمل‏هاي بافت به وضعيت‏هاي گوناگون كشت سلولي نياز به وسيله اي براي ارزيابي زيست پذيري سلول‏هاي حاصل از اين شرايط را دارد. سنجش زيست پذيري در بهينه سازي روش‏هاي كشت اوليه نسبتاً راحت است. بهترين راه براي ارزيابي زيست پذيري سلول استفاده از روش‏هايي است كه اثر تروما را مورد ملاحظه قرار مي دهد. به طور كلي كاهش استحكام (يكپارچگي) غشاء سلول در آخرين مراحل تروما اتفاق مي افتد كه اين امر منجر به تخمين بيش از اندازه زيست پذيري سلو مي گردد. براي مثال شروع و پيشرفت اپوپتوسيس (opoptosis) بدون ايجاد اختلال در غشاء سلول رخ مي دهد. با وجود تركيب دوباره فسفوليپيد‏ها معمولاً فسفا تيديل سرين با ورقه داخلي غشاء دولايه پلاسما مرتبط شده و در طول اپوپتوسيس به قسمت بيروني منتقل مي شود. آرايش نهايي سلول كه آشكار شدن آن ممكن است مدت‏ها طول بكشد تا حد زيادي به وقايع زيان آوري كه عامل آغاز آپوپتوسيس است بستگي دارد. از طرف ديگر آسيب ممكن است چنان شديد باشد كه يكپارچگي سلول در چندين دقيقه لطمه ببيند، بنابراين ارزيابي يكپارچگي سلول مي تواند مفيد باشد.

آزمون‏هاي زيست پذيري مختلفي براي اندازه گيري يكپارچگي غشاء وجود دارد. يكي از متداولترين روش‏ها، ممانعت آبي تريپان نام دارد كه بر مبناي ويژگي ممانعت سلول‏هاي زنده و رنگي شدن آنها و نفوذپذيري سلول‏هاي غير زنده و رنگي شدن آنها استوار است. اين آزمون شامل نگهداري سوسپانسيون سلول براي مدت كوتاهي
(min 5<) است. دليل كوتاه بودن اين زمان آسيب ديدن سلول‏هاي زنده و جذب رنگ توسط آنهاست.

يك نمونه از سنجش مستقيم جذب رنگ توسط سلول‏هاي زنده در ذيل آمده است. سلول‏هاي زنده رنگ غير فلورسنت دي استيل فلورسئين را ميگيرند، سپس درون سلول استيل مويتيز آزاد شده و فلورسئين توليد مي گردد كه فلورسنت بوده و غشاء سلول نسبت به آن ناتراوا است. در طول موج‏هاي گسيلي با تحريك مناسب سلول‏هاي زنده، رنگ فلورسان سبز از خود ساطع مي‌كنند. اين خصوصيت را مي توان هم با محاسبه بصري توسط ميكروسكوپ فلورسان و هم توسط تفكيك سلولي اندازه گيري كرد. سرم مي تواند دي استيل فلورسئين را هيدروليز كند، بنابراين آزمون‏هاي به اصطلاح طولاني مدت در صورتي كه سرم جزئي از ماده باشد توصيه نمي شود. همچنين فلورسانس فلورسئين بستگي به PH داشته و نيازمند بافرهاي (تثبيت كننده‏هاي) غير بيوكربناتي است. اين عامل عمدتاً در آزمون بقا سنجي از دخول محيط كشت سلولي جلوگيري مي كنند مگر اينكه توسط بافرهاي موثر غير بيوكربناتي مانند HEPES يا بافرهاي آلي ديگر محافظت شوند.

حساسيت بهتر با تركيب يدپروپيديم و دي استيل فلورسئين به دست مي آيد. يديروپيديم نسبت به سلول‏هاي زنده ناتراوا و نسبت به سلولهاي غير زنده تراوا است. تحت اين شرايط سلول‏هاي زنده از خود نور سبز فلورسانت و سلول‏هاي غير زنده نور قرمز روشن (درخشان) ساطع مي كنند. در مقايسه با روش تريپسين آبي مشخص مي شود كه پايداري روش دي استيل فلورسئين- يدپروپيديم در حضور رنگ‏ها در مدت زمان طولاني بيشتر است. وضعيت انرژي سلول با توجه به غلظت نوكلئوتيد آدينيليت يكي از نشانه‏هاي مهم زيست پذيري به شمار مي رود. اين رابطه به دليل دخالت ميتوكندري در آغاز اپوپتوزيس منطقي است. يكي از پارامترهاي سطح انرژي سلول بار انرژي است اين شاخص توسط نسبت ذيل معين مي‌شود:

[ATP]+0.5[ADP]/[ATP]+ADP]+[AMP] مقدار اين نسبت براي سلول‏هاي طبيعي در حدود 9/0 بوده و شروع كاهش از اين مقدار نشانگر آغاز اتلاف زيست پذيري است. براي مثال اندوتليال كشت شده و سلول‏هاي P388D1 پس از تحمل تنش اكسيد كننده ‍(اكسيدانت) افت بار انرژي از 95/0 تا 66/0 را در دقيقه اول نشان مي دهند، در صورتي كه در روش تريپان آبي تا قبل از 30 دقيقه نخست پس از شروع تنش هيچ گونه تغييري مشاهده نمي شود.

-گزينش                                                                                                                           SELECTION

گزينش بر اساس خاصيت‏هاي منحصر به فردي كه يك سلول را از ديگري متمايز مي‌كند مانند چگالي اندازه، نشانه‏هاي اختصاصي (ماركر) گذر راههاي منحصر به فرد متابوليكي و احتياجات غذايي صورت مي پذيرد.

-چگالي و اندازه                                                                               DENSITY AND SIZE

در سانتريفوژ نرخ ته نشيني ذرات به نيروهاي اعمال شده چگالي و وسكوزيته مايع بستگي دارد. بنابراين با يك نيرو و ويسكوزيته معين نرخ ته نشيني متناسب با اندازه ذره و اختلاف بين چگالي ذره و چگالي مايع خواهد بود. در نتيجه نرخ ته نشيني در زمان صفر شدن اختلاف بين چگالي ذره و چگالي مايع به صفر نزديك مي شود. همچنين نرخ ته نشيني با افزايش نيروي سانتريفوژ افزايش يافته و در اثر بالا رفتن ويسكوزيته مايع كاهش مي يابد.

از آنجا كه چگالي و ويسكوزيته مايع اثر قابل ملاحظه اي بر نرخ ته نشين ذرات دارد مواد و محلول ‏هاي گرادياني گوناگوني بر اساس اين خواص توسعه پيدا كرده اند. مواد كنتراست تركيب شده با «يد» كه در ابتدا براي مطالعات باليني كنتراست اشعه x توسعه يافتند در ايزولاسيون سلولي نيز مفيد واقع شدند. سري‏هاي مختلفي از اين مواد كنتراست بر اساس ساختار يوني غير يوني، منومري يا ديمري وجود دارند. دامنه اين مواد از متريزوات تا متريزاميد گسترش يافته است. (كه اولي از گونه غير يوني است) و نيكودنز كه يك ماده با سميت كمتر بوده و و براي ايزولاسيون نوتروفيل‏ها، پلاكت‏ها، سلول‏هاي استليت (ستاره شكل) پري آسينار لوزالعمده يا سلول‏هاي كوپفر استفاده مي شود. فيكول كه يك پلي سوكرز مصنوعي است به طور گسترده در ايزولاسيون گونه‏هاي سلولي مگا كاريو سيتها هپاتوسيت‏ها، سلول‏هاي جزاير لوزالعمده، نوتروفيل‏ها و لنفوسيت‏ها به كار برده مي شود. تركيب دياتريزوات سديم (ماده كنتراست يوني-هيپاك) با فيكول يا تركيب متريزوات سديم با فيكول (ليمفوپرپ) عمدتاً در گزينش سلول‏هاي خوني به كار گرفته مي شود. يك ماده گزينشي نسبتاً جديد، پركول است كه از كلوئيد سيليس پلي ديسپرس با پوشش پولي ونيل پيرليدن (PVP) تشكيل شده و كاربرد فراواني پيدا كرده است. پوشش PVP سبب خنثي كردن نسبي سيليس از نظر پايداري PH و استقامت يوني فيزيولوژيكي مي شود. براي ديدن مباحث مربوط به انواع سلول‏هايي كه توسط پكرول از خون و ارگانهاي مختلف ديگر جدا شده اند به منابع مراجعه كنيد. اين مواد گزينش گر به عنوان نخستين گام در كاهش سلول سازي تركيبات سلولي به نحوي كه ديگر روش‏هاي خاص جدا سازي را نيز بتوان به خدمت گرفت استفاده ميشوند.

اين مواد گرادياني اجازه تشكيل محلول‏هايي با چگالي مناسب براي باند كردن سلول‏ها طبق چگالي شناوري (buoyant) بدون اينكه سلول‏ها تحت هيچ گونه تنش اسمزي يا يوني قرار داشته باشند را مي دهد. ماده گرادياني قادر است كه بر اساس چگالي يا اندازه سلول‏ها را تفكيك كند. براي گزينش بر مبناي چگالي ماده گرادياني به نحوي ساخته مي‏شود كه حيطه چگالي آن كل محدوده چگالي سلول‏هاي موجود در تركيب را در بر ميگرد. اين فرايند جهت اطمينان از اين مسئله است كه تحت نيروي سانتريفوژ اعمال شده، سلول‏ها به سطح تعادلي تحت عنوان سطح ايزوپيكنيك رسيده اند كه در اين سطح چگالي محيط ميشوند. تحت اين شرايط اندازه نقش مهمي را ايفا نمي‌كند.

چگالي يك سلول مي تواند توسط خاصيت اسمزي محلول تحت تأثير قرار بگيرد. در يك محيط‏هايپرتونيك (پرفشار) سلول كوچك شده و چگالي شناوري به واسطه حذف آب افزايش مي يابد زيرا ماده‏هايپرتونيك سلول‏ها را متورم كرده و چگالي شناوري آنها را كاهش مي دهد. ميزان اسمزي يك ماده بخصوص در هنگام جداسازي ايزوپيكنيك بايد كنترل شود. مشخصه اين مواد نشانگر توانايي آنها در رسيدن به كنترل غير وابسته به چگالي و خاصيت اسمزي است.

جداسازي سلول‏ها بر اساس اندازه يا سرعت نيازمند اين است كه ماده گرادياني كم چگال تر از سلول‏هاي موجود در تركيبي باشد كه بايد جداسازي شود. تحت اين شرايط گرادياني سلول‏ها وضعيت ايزوپيكنيك نداشته و جداسازي بر اساس اندازه مشخص مي شود به اين صورت كه سلول‏هاي بزرگ سريعتر از سلول‏هاي كوچك جابجا مي شوند. اين وضعيت قبل از رسيدن سلول‏ها به كف لوله متوقف مي شود. جداسازي ايزوپيكنيك به سرعت سانتريفوژ بالاتري نسبت به جداسازي سرعتي نياز دارد. اگر سلول مورد نظر به سرعت‏هاي بالا حساس باشد در جداسازي ايزوپيكنيك بايد توجه كافي مبذول شود.

براي دستيابي به موادي با چگالي‏هاي مختلف از روشهاي پيوسته يا ناپيوسته استفاده مي شود. گراديان‏هاي ناپيوسته، تغييرات ناگهاني و يا واسطه‏هايي را در طول لوله سانتريفوژ ايجاد مي كنند. تغيير يك چگالي خاص در هنگامي كه ماده جداساز به عنوان بالشتك عمل مي‌كند مي تواند عمل جداسازي سلول را انجام دهد مانند وضعيت لويكوسيت‏هاي تك هسته اي در زمان استفاده از گراديان پكرول. همچنين مي توان از يك سري تغييرات ناگهاني چگالي براي جداسازي اعصاب دوپا مينرژيك شكمي و سينه اي جنين موش و جداسازي اسپرم بارور X از اسپرم بارور Y استفاده كرد. گراديان‏هاي چگالي ناپيوسته بدليل جمع شدن سلول‏ها در حد فاصل‏ها مي توانند سبب ايجاد عوامل خارجي ناخواسته (آرتيغكت) شده و شناخت سلول‏هاي با چگالي متفاوت وابسته به ناهمساني چگالي در گراديان‏هاي ناپيوسته را مشكل مي سازند. گراديان‏هاي پيوسته به وسيله گراديان سازها يا به صورت پكرول توسط گراديان‏هاي خود ساز شكل ميگرند. پكرول در اثر نيروي سانتريفوژ بيشتر از g10000 شروع به ته نشيني مي‌كند. و از آنجائي كه پكرول يك كلوئيد چند طيفي (پلي ديسپرس) است ذرات با نرخ‏هاي متفاوت ته نشين مي شوند كه سبب ايجاد گراديان نرم ميشود. تحت اين شرايط ممكن است سوسپانسيون سلول با پكلرول آميخته شده و عمل سانتريفوژ در سرعت‏هاي بالا منجر به توليد گرادياني شود كه پس از آن، سلول‏ها بر اساس گراديان شكل گرفته جدا مي شوند. در اين مورد دو نگراني وجود دارد. اول اينكه نرخ بالاي سانتريفوژ ممكن است به سلول‏ها آسيب برساند و دوم اينكه احتمال جذب پكرول توسط ليزوزوم‏ها وجود دارد البته پكرول جهت جداسازي انواع ليزوزومال‏هاي با چگالي‏هاي مختلفي در هپاتوسيتهاي موش بدون تأثير در چگالي ليزوزوم‏ها به كار برده مي شود.

-نشانه‏هاي اختصاصي (ماركر)سلول                   UNIQUE CELL MARKERS

ساختمان سلول‏ها در بافت‏ها با توجه به عملكردشان در درون سلول ناهمگن است. اين ساختارها نه تنها نشانگر عملكرد منحصر به فرد سلول‏هاست بلكه وسيله اي براي تشخيص آنها مي باشد بخصوص اگر اين ساختار در سطح سلول باشد. گزينش استثنائي پادتن‏هاي منوكلونال (تك تاگي) سبب ايجاد روش‏ها و تجهيزات مختلفي شده است كه به منظور بهره برداري از اين اختلافات به كار برده مي شوند.

-دسته بندي سلول فلورسنت فعال شده (FACS)

Fluorescent- Activated Cell Sorting (FACS)

دسته بندي سلول فلورسنت فعال شده به روش سلول سنجي (سايتومتري) روان انجام مي شود كه يكي از پيشرفته ترين تجهيزات در جهت بهره برداري از تكنولوژي پادتن‏هاي منوكلونال مي باشد. عملكرد اين دستگاه بر اساس قابليت ايجاد جرياني از سلول‏هاي منفرد است كه به طور انتخابي توسط صفحات منحرف كننده با بارهاي مخالف قابل تغيير جهت هستند. در ابتدا تركيبي از سلول‏ها با پادتن‏هاي مونوكلونال جفت شده با نشانه‏هاي فلوروسنتي نگهداري ميشود، سپس سلول‏هايي كه داراي اپيتوپ (epitope) مناسب هستند با پادتن‏هاي نشان دار باند مي شوند. در اين دستگاه تركيب به صورت جرياني از سلول‏ها در مي آيند كه به وسيله مبدل لرزشي به قطره‏هاي كوچك شكسته مي شود. سپس باريكه ليزر به سلول‏ها تابانده شده و پرتو حاصل توسط فوتومالتي پلير (تشديد كننده نوري) دريافت مي گردد و متعاقباً پردازش انجام مي گيرد. سلول‏ها در خلال اين پردازش به نحوي باردار مي شوند كه به خوبي توسط صفحات باردار منحرف كننده قابل انحراف باشند. از آنجا كه دستگاه قادر به انتگرال گيري كليه اطلاعات است پس از برخورد باريكه ليزر با سلول‏هاي مورد نظر، يك بار مختصر به صفحات منحرف كننده اعمال مي شود كه نتيجه آن انحراف سلول‏هاي نشان دار و از دست رفتن سلول‏هاي بدون نشان است به طور كلي عمل جداسازي در دستگاه FACS بر اساس هر گونه خصوصيت سلولي كه توسط پراكندگي يا انتشار نور باشد انجام مي‏گيرد. با توجه به پيچيدگي دستگاه، عمل دسته بندي مي تواند بر روي بيشتر از يك پارامتر انجام شود، از جمله، اندازه گيري شكل سلول اندازه سلول و انواع ويژگي‏هايي كه توسط برچسب گذاري فلورسانس (نشانه گذاري فلورسانس) قابل بررسي هستند. شناسايي سلول‏ها در سيستم هماتوپوئيتيك (خون سازي) با استفاده از روش سلول سنجي روان انجام پذيرفته است. اين سلول‏ها به خوبي قابل تشخيص بود و پادتن‏هاي مونو كلونال فراواني در تضمين نتيجه بخش بودن آنها وجود دارد. اين شناخت به همراه ايزولاسيون مي تواند كاملاً مؤثر بوده و در نتيجه سلول‏هاي كم چگالي توسط اين روش به خوبي تفكيكي مي شوند.

-دسته بندي رشته اي ايمني مغناطيسي و دسته بندي سلول مغناطيس فعال شده (MACS)

 Immunomagnetic Bead Sorting and Magnetic Activated Cell Sorting (MACS)

روش دسته بندي رشته اي ايمني مغناطيسي و دسته بندي سلول مغناطيسي فعال شده از پادتن‏هاي مونوكلونال و ديگر مولكول‏هاي گزينش شده با خاصيت مغناطيسي براي گزينش سلول سود مي برد. به طور كلي، در اين روش تركيبي، آميزش سلول با پادتن اصلي مونوكلونال براي اپيتوپ معيني نگهداري مي شود. رشته‏هاي مغناطيسي با پادتن‏هاي ثانويه گوناگوني پوشيده شده و سلول‏ها و رشته‏ها با هم رشد مي يابند. سلول‏هاي نشاندار ويژه با اتصال به ذرات مغناطيسي پادتن ثانويه را حمل مي كنند. لوله اي كه تركيب فوق را حمل مي‌كند در مقابل مغناطيس قرار داده مي شود در نتيجه رشته‏هاي حامل سلول به سمت مغناطيس كشيده مي شوند. سلول‏هاي غير متصل به رشته مغناطيسي را مي توان به بيرون منتقل كرد، اين فرايند را مي توان چندين بار تكرار نمود تا سلول‏هاي غير متصل به كلي خارج شوند.مثالي از اين روش در مطالعات تصفيه سلول‏هاي  از جزاير لانگرهانس موش آورده شده است. يك نمونه از گزينش غير پادتني كه رشته مغناطيسي را مورد استفاده قرار مي دهد در مطالعاتي كه در آن سلول‏هاي اندوتليال ميكروشرياني از داخل جزاير لانگرهانس پاكسازي شد، آمده است. رشته‏هاي پوشيده شده با آلگولتينين-1 اولكس يوروپاوس (Ulex europaus) براي باند كردن سلول‏هاي اندوتليال شريان‏هاي بسيار كوچك استفاده شدند. اين ايزولاسيون نشان دهنده ويژگي منحصر به فرد سلول‏هاي اندوتليال است كه نظريه مبني بر اهميت محل آناتومي درحالت فنوتيپيك سلول‏هاي مشابه را تأئيد مي‌كند. گزينش مي تواند مثبت يا منفي باشد: مثبت يعني سلول مورد نظرنشان دار بوده و تحت تأثير ميدان مغناطيس قرار مي گيرد و منفي يعني آلاينده سلول غالب نشان دار بوده و باند شده است و سلول مورد نظر پاك گرديده است(منتقل گرديده است.)

مزيت گزينش منفي اين است كه سلول‏هاي مورد نظر به رشته‏هاي مغناطيسي پيچيده نشده ولي رشته‏هاي بزرگ ممكن است بر اتصالات بعدي روي سطوح كشت بافت تأثير بگذارند. اگر نياز به گزينش مثبت باشد پاكسازي رشته‏ها از سلول‏هاي مورد نظر صورت گرفته و اين عمل با استفاده از ضدسرم ضد فب (anti-Fab) انجام مي شود. رشته‏ها توسط گوارش آنزيمي پاك مي شوند اما اين كار ممكن است بر سلول تأثير بگذارند. دو روش ديگري به نام گزينش سلول (CELLection) DNA كوتاه بين رشته اي و پادتن توسط دي (DNASE) از هم باز مي شوند. در اين روش رشته‏هاي داينا (Dyna beads) از داينال (Dynal) مورد استفاده قرار مي گيرند. طراحي ديگر رشته MACS كه توسط ميلتني بيوتك با مسئوليت محدود صورت گرفت اين معايب را ندارد اگر چه رشته‏هاي داينا از ديدي ديگر با توجه به داشتن توانايي در احياي سريع سلول يك مزيت به حساب مي آيند. استفاده از رشته‏هاي ميلتني nm 50 به يك ستون گزينش نياز دارند. در قسمت نخست ستون سلولهايي قرار دارند كه داراي نشان‏هاي ويژه هستند. باقيمانده ستون را تا زماني كه ميدان مغناطيسي برقرار است، رشته مغناطيسي تشكيل مي دهد. ستون فوق قابل شستشو بوده و در اثر شستشو سلول‏هاي غير متصل به رشته مغناطيسي خارج مي شوند. به محض برداشتن ميدان مغناطيسي از روي ستون سلول‏هاي متصل به رشته شسته مي شوند. مطالعات انجام شده بر روي رشته‏هاي داينا و سيستم ستون‏هاي ميلتني از ميدان‏هاي نسبتاً مغناطيسي مرتبط با اين ذرات بهره مي برند. در اين دو مرحله گزينش دو نوع سلول نشانه دار سطحي بدون حذف اولين مجموعه از رشته‏هاي مغناطيسي به كار برده مي شوند. در ابتدا گزينش مثبت با سيستم ميلتني رخ مي دهد كه توسط گزينش مثبت يا منفي رشته‏هاي داينا دنبال مي شود. توان مغناطيسي گزينش گر داينال قادر به جذب رشته‏هاي بزرگ تر داينا بوده اما توانائي جذب رشته‏هاي كوچك ميلتني را ندارد.

دستگاه FACS براي دسته بندي سلول پرهزينه است. بنابراين دسته بندي مغناطيسي به عنوان روش ايزولاسيون و گردآوري سلول در هنگام استفاده از پادتن‏هاي مونوكلونال براي جداسازي سلول‏ها ترجيح داده مي شود. هر دو اين روش‏ها براي كار با سيستم سلول خون سازي نسبت به سلول‏هاي بافت‏هاي ديگر سازگارتر هستند. سلول‏ها سيستم خون سازي تا حدود زيادي با ماتريس برون سلولي (extracellular matrix) ارتباط نداشته و به خوبي براي سوسپانسيون (تعليق) كارآيي دارند. اين دو مشخصه شرايط لازم براي بهره گيري از مزاياي اين روش‏ها را فراهم مي‌كند. با اين وجود سلول‏هاي بافت‏هاي سخت ذيل توسط اين گونه روشهاي ايمني گزينش مي شوند: سلول‏هاي كشت يافته ماهيچه‌اي سلول‏هاي اندوتليال آئورت، گزينش سلول‏هاي لومينال ومايواپيتليال پستاني، گزينش بخش‏هاي مختلف نفرون پروگزيمال، غني سازي زير جمعيت‏هاي سلول‏هاي اپيتليال تنفسي و گزينش سلولهاي حاوي كالي كرين از سلول‏هاي لوله اي كليوي محدوديتي كه براي سلول‏هاي غير خون ساز وجود دارد چسبندگي بيشتر آنهاست كه اجازه شارش مناسب در ستون‏ها را نمي دهد. گردش جريان در FACS از سلول‏هاي توده اي جلوگيري مي كند، بدين ترتيب سبب بهبود خلوص مي گردد.

از آنجا كه ميزان نشانه‏هاي اختصاصي سلول در بافت نسبت به زمان گذرا است اين روش بايد به سرعت در روند ايزولاسيون اعمال شوند تا احتمال حضور نشانه‏هاي مطلوب افزايش يابد. سلول‏هاي اپيتليال در شرايط كشت سلولي استاندارد قطبيت و عملكرد متمايز خود را از دست مي دهند، هپاتوسيت يك نمونه قابل ذكر در اين مورد است. انواع ديگر سلول‏ها نيز با حالت‏هاي مشابه به شرايط كشت سلولي استاندارد پاسخ مي دهند. باقي ماندن سلول‏ها به حالت تعليق (سوسپانسيون) براي مدت زمان طولاني مي‎تواند آنوئيكها را فعال كرده و زيست پذيري و توليد سلول را كاهش دهد. علاوه بر اين، سلول‏هاي تحت آزمايش FACS و گزينش ايمني مغناطيس سلول، نشان دهنده تغييراتي در يكپارچگي غشاء بوده كه به واسطه نيروهاي هيدروديناميك يا ميدان‏هاي مغناطيسي ايجاد شده است. همچنين رشته‏ها مي توانند با مصرف آنتي ژن مقادير قابل ملاحظه اي از آن را از سطح سلول‏هاي زنده و فعال جدا كنند. ايزولاسيون آئوزينوفيل‏ها (آئوزين پذيرها) توسط MACS نشان دهنده تضعيف عكس العمل نسبت به جاذب‏هاي شيميايي LTB4 و PAF است در حالي كه تصفيه اوليه پكرول به اين صورت بر ائوزينوفيل تأثير نمي گذارد.

يكي از تفاوت‏هاي بين FACS و MACS اين است كه FACS مي تواند كمي (سنجش پذير) باشد. از آنجا كه درجه فلورسانس مي تواند معياري براي FACS باشد، امكان ايزوله كردن سلول با درجات مختلف شدت فلوروسانس وجود دارد. در مورد MACS، مسأله به فرم همه يا هيچ است. البته تركيب MACS و سانتريفوژ با گراديان چگالي مي تواند تمايزاتي بر اساس درجه ميزان آنتي ژن موجود در سطح فراهم كند. سلولي كه ميزان آنتي ژن بيشتري داشته باشد داراي رشته‏هاي متصل بيشتري بوده و درنتيجه چگالي بالاتري خواهد داشت، چنين سلولهايي در گراديان چگالي سريعتر ته نشين مي شوند.

تركيب فرايند دسته بندي سلول فعال شده فلورسانس و رشته مغناطيسي براي ايجاد تصفيه بهتر لازم نيست. قرار دادهاي تأئيد نشده در مورد موضوع خون سازي براي همه سلول‏هاي بافت‏هاي سخت مناسب نيست. شايد توسعه روش‏هايي براي غلبه بر محدوديتهاي بالا لازم باشد. چنين تلاشي كاملاً مفيد بوده و در مواردي ضروري است. سلول‏هاي اجدادي (Progenitor) تقريباً در كليه اندام‏هاي يك ارگانيزم رشد يافته پيدا مي شوند. ايزولاسيون اين سلول‏ها به روش‏هاي ايزولاسيون حساس نيازمند است. اين سلول‏ها به سختي قابل رؤيت بوده و بنابراين روش‏هاي ماكروايزولاسيون كه ايزولاسيون سنتي كشت سلولي را شامل مي شوند مناسب نخواهند بود قرار دادهاي موجود براي سلول‏هاي خون ساز مي تواند پايه اي براي پيشرفت‏هاي بيشتر باشد. با ملاحظه شرايط ذكر شده فوق، اين قرار دادها را مي توان تقريباً براي هر سلولي كه به طور مناسب توسط نشانه‏هاي اختصاصي نشان دار شده باشد به صورت موفقيت آميز توسعه داد.

-جداسازي                                                                                                                     Panning

جداسازي روش ايمني ديگري است كه در آن لكتين‏ها براي باند كردن انواع سلول‏هاي خاص مانند سلول‏هاي اپيتليال لثه پيوندي يا سلول‏هاي اپيتليال آرواره اي ‍(آلوئولار) نوع II مورد استفاده قرار مي گيرند. ظروف كشت سلولي با پادتن مناسب يك نشانه خاص سلولي تركيب مي شوند. سپس مخلوط سلول به ظروف كشت سلولي پوشيده شده با پادتن اضافه مي گردد. در اين حالت سلول‏هاي نشانه دار به ظرف چسبيده و سلول‏هاي بدون نشانه به آساني خارج مي شوند. اين روش به قابليت سطحي كه پادتنها به آن مي چسبند بستگي دارد، تا كمترين جاذبه را براي سلول‏هاي ناخواسته داشته باشد، در غير اين صورت تمايز بين سلولي كاهش مي يابد. عمل جداسازي در مدهاي مثبت يا منفي قابل استفاده است؛ وضعيت مثبت براي انتخاب سلول‏هاي مطلوب و منفي براي انتخاب و خارج سازي سلول‏هاي نامطلوب در نظر گرفته مي شود. به منظور خارج سازي سلول‏هاي جدا شده از طرق آنزيمي و مكانيكي مي توان بهره برد. اين روش براي ايزوله كردن سلول‏هاي تروفوبلاست انسان از تركيب پرزهاي جفت جفت تريپسين زده سلول‏هاي آغازين ژرم، و فيبروبلاست ها از تركيب كراتينوسيت، براي گزينش مثبت سلولهاي لانگرهانس و كراتينوسيتها و لنفوسيت‏ها مورد استفاده قرار ميگيرد.

-مشخصه‏هاي غذايي و متابوليكي (سوخت وساز)

از نيازهاي غذايي و متابوليكي گوناگون سلول‏هاي مختلف نيز مي توان به منظور گزينش در خلال ايجاد كشت‏هاي اوليه بهره گرفت. در اين موارد شرايط از اهميت ويژه اي برخوردار هستند زيرا پاسخ سلول‏ها به اين وسايل ممكن است به شرايط معيني احتياج داشته باشد. براي مثال، سميت مورد نظر ممكن است در حضور سرم به واسطه داشتن پتانسيل سم زدايي ظاهر نشود. همچنين از آنجا كه سرم شامل مجموعه گوناگوني از مواد غذايي است، بهره گيري از احتياجات غذايي مختلف در حضور سرم دشوار مي شود. (تضعيف مي شود).

-متابوليك (سوخت و ساز)METABOLIC                                                      

ايزوزيم‏ها (Isozymes) به طور ناهمگني در ميان انواع مختلف سلول‏ها توزيع شده اند استرازهاي غير خاص نمونه‏هاي خوبي از اين پديده به شمار مي روند. حالت‏هاي متفاوت استراز ايزوزيمها در سلول‏هاي اندتليال و پريسايت‏ها مبناي اصلي تمايز بين اين دو نوع سلول است. غلظت mM 50 ال- لوسين متيل استر براي سلول‏هاي اندوتليال سمي بوده ولي براي پريسايت‏ها سمي نمي باشد و منجر به ته نشيني سلولهاي اندوتليال مي گردد. به طور مشابه ال- لوسين- ال- لوسين متيل استر در مقايسه با سلول‏هاي B و T كمك كننده ترجيحاً لنفوسيت‏هاي سمي را مي كشد. ليزوزمال تيول پروتئاز دي پپتيديل پپتيدازI، مي تواند ال- لوسين- ال- لوسين متيل استر را به محصولات هضم كننده غشاء تبديل كند. در غلظت‏هاي بالا آنزيم در لنفوسيتهاي سمي بيشتر از سلوهاي ديگر ظاهر مي شود كه در نهايت ته نشين مي شوند. همچنين تحليل گرانولوسيت‏ها و مونوسيت‏ها از سلول‏هاي تجمع يافته افرسيس را مي توان با تكوين در كنار ال- فنيلالانين متيل استر هيدروكلرايد به دست آورد. سپس سلولهاي CD34+ به وسيله ايزولاسيون رشته مغناطيسي تصفيه مي شوند. پالايش اوليه گرانولوسيتها و مونوسيتها بازدهي ايزولاسيون را افزايش مي دهد.

آلاينده فيبروبلايست يك مشكل متداول در كاشت بافت مي باشد. تلاش براي كنترل رشد فيبروبلاست با استفاده از بهره برداري از فقدان فعاليت ال-آمينو اكسيداز، آنزيمي كه دي- والين را به ال- والين تبديل مي‌كند، انجام مي شود. سلول‏هاي مطلوب نيازمند انجام اين تبديل به طور مناسب هستند. در ماده اي كه دي والين جايگزين ال-والين مي شود قابليت گزينش مشاهده مي شود. البته گزارشات ضد و نقيضي در اين مورد وجود دارد. فيبروبلاست‏ها از گليوبلاستوماي چند شكل و اوليگودندروگليوما در محيطي كه در آن دي- والين جايگزين ال- والين مي شود كشت مي گردد و با محيط استاندارد حاوي ال-والين مقايسه مي شود. هر سه نوع سلول در برابر دي- والين مقاومت كرده و تغيير شكل مورفولوژيكي قابل ملاحظه اي دارند. همچنين با وجود اينكه احتمال توقف فيبروبلاست‏ها توسط دي-والين وجود دارد اما آنها لزوماً كشته نشده و ممكن است با قرار گرفتن دوباره سلول در محيط حاوي ال-والين شروع به رشد نمايند. در انتها نتيجه ميگيريم كه دي والين جلوي رشد فيبروبلاست انساني را در محيط آزمايشگاه نمي گيرد. قبل از انجام هر گونه تلاشي براي متوقف كردن رشد فزاينده فيبروبلاست توسط ماده دي- والين، عوامل متعددي بايد در نظر گرفته شود. اول اينكه دي والين تهيه شده بايد داراي آلاينده ال- والين كمي باشد. مقادير كم ال-والين ممكن است سبب كاهش سرعت تكثير شود اما باعث طولاني شدن بقا مي گردد. همچنين غلظت بهينه دي-والين ممكن است برابر غلظت اصلي ال-والين نباشد. ميزان تأثير دي-والين به اندازه ايزومر-ال نمي باشد. ميزان بازدهي جابجائي نسبي دي- والين و ايزومر –ال يكسان نبوده و در درون سلول، دي والين به نوع ال تبديل مي شود. زمان مورد نياز براي اين فرايند سبب افزايش الزامات براي نوع دي مي گردد. به طور ايده آل در صورت امكان بهتر است ماده اي عاري از دي- ال- والدين تهيه شده و سپس با غلظت مناسب دي والين مورد نياز تيتر كرد.

هپاتوسيت شامل يك چرخه مؤثر اوره مي باشد. در نبود ال- آرژنين هر يك از چرخه‏هاي مياني اوره قادر به بازسازي ال-آرژنيني است. از نظر سنتي براي جايگزيني ال- آرژنين از ال- اورنيتين استفاده مي شود. ديگر آلاينده‏هاي بالقوه سلول در ايزولاسيون هپاتوسيت داراي فعاليت چرخه اوره قابل ملاحظه اي نبوده و در نبود ال-آرژنين زنده باقي نمي مانند. ظاهراً احتمال رخ دادن عمل تغذيه متقابل(cross feeding) در هنگامي كه هپاتوسيتها ماده را براي سلول‏هاي آرژنين غير قابل تكثير آماده مي كنند بسيار كم است.

سودمندي ماده عاري از ال- آرژنين بستگي به چرخه عملياتي اوره دارد. هر گونه آسيب سلولي كه به طور مستقيم يا غير مستقيم بر چرخه اوره تأثير بگذارد بر زيست پذيري هپاتوسيتها تحت شرايط عاري از آرژنين نيز اثر مي گذارد. اگر شك داشته باشيم كه وجود هپاتوسيتها مطلوب يا نامطلوب است استفاده از ماده عاري از ال-آرژنين توصيه نمي شود. به طور كلي اين سطح گزينش ضروري نيست، زيرا هپاتوسيتها را مي توان در كشت اصلي با بهره گيري از اختلاف فاحش اندازه سلول بين هپاتوسيتها و ديگر سلولهاي كبد با خلوص بالا به دست آورد.

شرايط كشت سلولي ديگر كه براي انواع سلولهاي مختلف انتخاب مي شود خاصيت اسمزي ماده است. سلول‏ها در برابر تغييرات اسمزي عكس العمل‏هاي تطبيق پذير ولي غير يكسان دارند. سلولهاي سرتولي ايزوله شده از لوله‏هاي تخمدان حاوي سلولهاي ژرم آلاينده مي باشند. ارائه محيط‏هاي كشت به يك محيط‏هايپوتونيك (كم كشش) براي مدت زمان معين منجر به پاك سازي انتخابي سلول‏هاي ژرم بدون تأثير قابل ملاحظه بر سلول‏هاي سرتولي مي شود. همچنين سلول‏هاي اپيتليال تجمع يافته مجراي دروني كليه زياد تطبيق پذير نيستند. علاوه بر اين مشاهده شد كه غلظت NaCl مي تواند بر افزايش سلول‏هاي اپيتليال تجمع يافته مجراي كليدهاي نوزاد خرگوش تأثير بگذارد.

-تغذيه ايNUTRITIONAL                                                                              حتي اگر سلول‏هاي تحت كشت با محيط آزمايش سازگار شوند. مشخصه‏هاي مهم فنوتيپ بدن را حفظ مي كنند مانند آنچه در مورد سلولهاي پروستات و نايژك‏ها نشان داده شده است. توانايي سلول‏ها درتكثير و بيان مشخصه‏هاي منحصر به فرد در كشت سلولي به فاكتورهاي رشد، سايتوكين‏ها، هورمونها، ماتريس‏هاي برون سلولي و تركيبات غذايي ماده وابسته است. درك عمكرد اين اجزاء براي فهميدن عملكرد و بقاي سلول‏ها در محيط آزمايشگاه لازم است.

شرايط غذايي سلول مورد نظر شامل تيتراسيون ميزان بهينه كليه اجزاء ماده مي باشد. براي دستيابي به اين هدف منحني‏هاي رشد با پاسخ‏هاي دوزي مختلف در چگالي‏هاي سلول كلونال (بافت- زاد) مورد نياز خواهد بود. شرايط كلونال به خاطر اينكه چگالي‏هاي بالاي سلولي ماده و معايب مبهم آن را تحت تأثير قرار مي دهد. مهم هستند اين فعاليت در هنگام استفاده از روش‏هاي سنتي بسيار وقت گير است. بهره گيري از سخت افزار و نرم افزار موجود براي تصويربرداري با ظرفيت پذيرش بالا مي تواند به طور قابل توجهي زمان مورد نياز براي تكميل تيتراسيون‏ها را كاهش دهد.

توسعه محيط عاري از سرم نشان دهنده وجود شرايط غذايي متفاوت براي انواع مختلف سلول است. با وجود مقادير زياد سلول‏هاي مورد نياز با اجزاء كيفي مشابه در محيط بازال خود شرايط كمي آن‏ها متفاوت خواهد بود. سلول‏هاي مختلف در يك ارگانيزم چند سلولي به وسيله مايع برون سلولي حاوي اكسيژن، دي اكسيد كربن، گلوكز، لاكتيت، آمينواسيدها و مواد غذايي مهم ديگر، فاكتورهاي رشد و هورمونهاي مشتق شده از پلاسما و يا سلولهاي محيط احاطه شده اند. از آنجا كه سلول‏هاي مختلف، برنامه‏هاي متابوليكي متفاوتي دارند اين محيط‏ها نيز متفاوت خواهند بود. براي مثال فيبروبلاست‏ها و كراتينوسيتهاي يك نمونه پوستي در محيط‏هاي مربوطه تكثير نمي شوند. تفاوت در غلظت كلسيم و آدنين ظاهراً مؤثرترين عامل در رشد انتخابي مي باشد. رشد بهينه كراتينوسيتها در غلظت‏هاي نسبتاً كم كلسيم رخ ميدهد. غلظت كلسيم بهينه براي فيبروبلاست سبب لايه لايه شدن كراتينوسيتها شده و آنها ديگر قابليت عبور سريال (زنجيروار) را در زماني كه غلظت بهينه كلسيم براي كراتينوسيتها در كمك به تكثير فيبروبلاست بسيار كم است نخواهد داشت. همچنين سلول‏هاي اپيتليال پستاني، فيبروبلاست‏ها توسط عكس العمل‏هاي متفاوت شان نسبت به شرايط زير بستري و اجزاء ماده از همديگر تشخيص داده مي شوند.

كلسيم اثر قابل ملاحظه اي پر وضعيت فنوتيپ سلول اپتيتال مي گذارد. غلظت نسبتاً بالاي كلسيم سبب لايه لايه شدن سلول‏ها شده و همان طور كه در سلول‏هاي اپيتليال مري موش مشاهده شد، عمل جداسازي را آسان مي‌كند. كراتينو سيت‏هاي سطحي پوست (اپيدرمال) موش با ميزان بهينه mM03/0 رشد كرده و در نهايت در mM0/1 كلسيم جدا مي شوند. سلول‏هاي اوروتليال انسان در mM06/0 كلسيم تكثير يافته و در غلظت‏هاي بالاتر جدا و پوسته مي شوند. سرم نيز مي تواند سلول‏هاي اپيتليال را از هم جدا كند. سلول‏هاي اپيتليال نايژك يك انسان طبيعي در حضور سرم به صورت پوسته پوسته جدا شده در حالي كه سلولهاي كار سينوم ريه در حضور سرم جدا نمي شود. همچنين شرايط كشت كه به رشد سلولهاي اپيتليال لومينال طبيعي كمك مي‌كند از رشد سلول‏هاي نئوپلاستيك حمايت نمي كند.

در يك محيط عاري از سرم يا مشخص از نظر شيميايي، تركيبات غذايي تاثير شديدي بر رفتار سلولي مي گذارد. شرايط تغذيه اي خاص، تكثير سلولي را محدود مي‌كند. فاكتورهاي رشد و مولكولهاي اطلاعاتي ديگر، همچنين ماتريس برون سلولي براي سلولهايي كه به طور طبيعي با آن در ارتباط هستند با تركيب ماده بازال بر هم كنش داده تا به يك فنوتيپ ويژه دست پيدا كند. اپيتلياي تجمع يافته در مجراي كليه جنيني به مواد مختلف با الگوهاي متفاوت پاسخ مي دهد. سري مواد MCDB 150 براي كراتينوسيتها توسعه يافته است. كاربرد MCDB 150 براي سلولهاي اپيتليال غده بزاقي موش نشان دهنده عدم توانايي براي زير كشت گسترده در محيط عاري از سرم است. البته افزايش سطوح بهينه در عصاره ايزولوسين به سلول‏هاي اپيتليال بزاقي اجازه مي دهد كه به صورت ترتيبي (سريال) زير كشت بروند.كراتينو سيتهاي انساني اثبات كننده نيازهاي غذايي به اينوزيتون و كولين تشديد اثر ميتوژنيك فاكتور رشد اپيدرمال توسط ال-سرين سرم، انسولين، فاكتور رشد كراتينوسيت وعصاره غده هيپوفيز گاوي است. همچنين حضور اتانولامين نياز سرمي سلولهاي اپيتليال پستاني موش را براي تكثير كاهش مي دهد. براي انواع سلولهايي كه نسبت به سرم عكس العمل نشان مي دهند سرم مي تواند با فراهم ‎آوردن مواد غذايي به محيط ميتواند سبب كم شدن نياز سرمي گردد.

در شرايط نبود سرم نياز غذايي آشكارتر مي گردد. غلظت بالاي پيروات ولاكتيت در كبد موش به همراه فعاليت گلوكز سنتز DNA را افزايش مي دهد. در نبود سرم مقدار كم سلنيوم براي رشد كلونال فيبروبلاست‏ها و خط سلول همستر چيني ضروري است. همچنين مقدار كم روي معدني با توجه به غلظت به كار رفته نشان دهنده اثر مثبت يا منفي آپوپتوسيس در تيموسيتهاي موش است. علاوه بر اين جداسازي پيگ پري اديپوسيت در محيط كم منيزيم دشوار است. همچنين گزينش سلول‏هاي لوله پروكسيمال انساني با استفاده از فرايند متابوليكي(سوخت و ساز) گلوكونئوژنيك موثر قابل دستيابي است. سلول‏هاي اوليه (اصلي) در يك محيط هورموني عاري از سرم بدون گلوكز يا انسولين كشت شده و در اين حالت سلول‏هايي كه قابليت گلوكز نئوژنزيس را ندارند آسيب مي بينند.

امكان ديگر بهينه سازي شيوه تركيبي است. يك ماده غني مانند M -199 Ham’s F12 يا سري MCDB به تنهايي يا به صورت تركيبي مورد استفاده قرا مي گيرند. اين عمل يك اقدام منطقي بوده و نتايج مطلوبي را به دنبال دارد. براي مثال سلول‏هاي ميان پوش روده اي كشت يافته در ماده M-199 عاري از سرم به منظور مطالعه تنظيم ترومبين ماتريس فعاليت متالوپروتناز استفاده مي شوند.

سلول‏هاي دانه اي (گرانولوزا) نارس خرگوش كشت يافته در M -199 براي بررسي آندروستندوئين و فيبرونكتين مختلف سلولي ايجاد شده توسط هورمون تحريك كننده غدد لنفاوي استفاده مي شوند. كاربرد تركيب دوليكو تصحيح شده توسط ماده ايگل و F12  Ham’s به همراه ماده بازال عصبي در محيط عاري از بافت در كشت نرون‏هاي بازال كولينرژيك پيشاني موش نشان داد كه مكمل فاكتور رشد به تنهايي براي جبران تركيب غذايي محدود كافي نيست. براي كشت اپيتليم انساني سطح تخمدان در يك محيط مشخص از تركيب ماده 199 يا MCDB 105 استفاده مي شود.

-نتيجه گيري

جهت تسهيل دشواري ذاتي عمل ايزولاسيون و گزينش تلاش‏هايي صورت گرفته است. بافت‏ها متغيرهاي طبيعي هستند كه در مقابل كشت از خود مقاومت نشان مي دهند. شرايط اوليه مانند عمر بافت و عملكرد بافت بسيار حياتي هستند. زيرا اين عوامل اثر تعيين كننده اي بر نتيجه نهايي دارند. محقق مي تواند با استفاده نادرست از شناسه‏ها و شرايط نامناسب در اتلاف زيست پذيري سهم داشته باشد. بنابراين در تعيين شناسه‏ها و فرايندها بايد دقت صد چنداني كرد. يكي از مقاصد اين فصل نشان دادن دشواري‏هاي ايزولاسيون و ملاحظاتي است كه در كسب موفقيت نهايي مفيد واقع مي شود.

گرگوري- اي- رات كوفسكي، چريل-اي- ميله، و سوريا- كي-مالاپراگادا

قالب گيري حلال يك روش ساده براي توليد ساختارها در مهندسي بافت است. در اين روش پليمر در يك حلال مناسب حل شده و در قالب ريخته مي شود. سپس حلال حذف گرديده و حالت پليمر را در شكل دلخواه (مورد نظر)حفظ مي‌كند اين شيوه به شكل هاي قابل حصول محدود مي شود. عموماً، صفحات صاف و لوله ها تنها طرح هاي قابل شكل گيري هستند اما با قرار دادن صفحات صاف روي هم نيز مي توان تركيبات پيچيده تري تهيه كرد (فصل 59، لايه بندي غشاء را ببينيد) فيلم ها را مي توان با شستن ذراتي مانند كريستال هاي نمك كاشته شده درون پليمر به صورت متخلخل در آورد. همچنين تركيب حلال- پليمر را مي توان در يك غير حلال پليمر كه قابليت مخلوط شدن در حلال اول را دارد قرار داد. اين روش به نام وارونگي فاز يا جداسازي (فصل 62، جداسازي فاز را ببينيد) شناخته شده و براي شكل دادن به غشاهاي متخلخل نامتقارن استفاده مي شود.

مزيت اصلي قالب گيري حلال، سادگي ساخت بدون احتياج به تجهيزات خاص است. همچنين به دليل اينكه عمل ساخت در دماي اتاق انجام مي گيرد نرخ تخريب پليمر زيست تخريب پذير به روش قالب‏گيري حلال كمتر از فيلم هاي قالب گرفته شده از طريق تراكم خواهد بود. (شكل 1-58) عيب اصلي قالب گيري حلال باقي ماندن احتمالي حلال سمي دورن پليمر است. براي رفع اين عيب بايد به پليمر اجازه داد تا كاملاً خشك شده و سپس با استفاده از خلا (مكش) حلال باقي مانده را خارج نمود. همچنين استفاده از حلال مي تواند ماهيت پروتئين و ديگر مولكولهاي موجود در پليمر را تغيير دهد كه اين حالت در فيلم هاي ساخته شده توسط شيوه هاي ديگر مانند قالب گيري تراكمي (فشاري) نيز مي تواند رخ دهد.

-انتخاب حلال CHOICE OF SOLVENT                                                             

فاكتورهايي را كه بايد در زمان انتخاب حلال در نظر گرفت عبارتند از: قدرت حلال، نرخ تبخير، ويسكوزيته، بقاي حلال و خصوصيات سميت. حلال ها به وسيله نيروهاي بين مولكوليشان طبقه بندي مي شوند (جدول 1-58). اينها فاكتورهايي هستند كه بر چگونگي بر هم كنش حلال با پليمر تأثير گذاشته و قدرت و بقاي حلال را تحت تأثير قرار مي دهد. پارامتر قابليت حلاليت براي تعيين قدرت حلال به كار برده مي شود. سرعت حل شدن پليمر توسط حلال متناسب با پارامتر قابليت حلاليت است. پارامترهاي قابليت حلاليت براي حلال هاي متداول در جدول 2-58 آمده است . پارامتر قابليت حلاليت براي پليمرها از طريق آزمايش و استفاده از حلال هاي مختلف يا بر اساس مقادير محاسبه شده بر روي گروهي از پليمرها تعيين مي شود. روش هاي توسعه يافته ديگري نيز وجود دارند كه از نيروهاي پاشيدگي(dispersion forces ),قطبيت و باند شدن هيدروژن در پارامتر حلاليت حدسي‌(نظري) استفاده مي كنند.

نرخ تبخير بستگي به نقطه جوش حلال دارد. حلال هايي با نقطه جوش پائين با نرخ سريعتري تبخير مي شوند. عمل خشك كردن فيلم قالب حلال در دو مرحله اتفاق مي افتد. در مرحله اول، حلال با نرخي تقريباً معادل با حلال خالص، تنها از فيلم بخار مي شود. و در نهايت فيلم به صورت ژلاتيني درآمده و تبخير به واسطه انتشار حلال در ميان پليمر محدود مي شود. در خلال اين مرحله، فاكتورهاي ديگري مانند نوع پليمر، حالت فيزيكي (شيشه اي يا لاستيكي) و ممانعت فضايي حلال بسيار مهم تر از تبخير است. حلال هاي بيشتري در پليمرهاي شيشه اي نسبت به پليمرهاي لاستيكي باقي مي مانند. شكل مولكول حلال وابسته به پليمر تعيين كننده انتشار حلال در ميان ماتريس است. همواره مقدار كمي حلال به واسطه تعادل ايجاد شده با پليمر در درون فيلم باقي مي ماند. مقدار حلال باقي مانده در درون پليمر بستگي به بر هم كنش حلال با پليمر دارد.

 

 

 

 

 

شرايط محيطي متفاوت مي تواند بر مقدار حلال باقي مانده در فيلم اثر داشته باشد. تبخير يك حلال در شرايط خاص توسط فشار بخار تعيين مي گردد. رطوبت هوا مي تواند نرخ تبخير را كاهش دهد. همچنين قرار دادن فيلم در خلاء تبخير حلال را افزايش مي دهد.گرم كردن فيلم هم سبب تبخير بيشتر حلال مي شود اما مي تواند باعث تخريب پليمر نيز شود.

ويسكوزيته يك سيال، معيار مقاومت آن در برابر شارش است. كه به دما، نيروهاي بين مولكولي و وزن مولكولي حلال بستگي دارد. براي يك محلول حلال- پليمر، ويسكوزيته مؤثر بستگي به بر هم كنش حلال- پليمر و ساختار و وزن مولكولي پليمر دارد. با اين حال، مدل هاي رياضي مانند معادلات مارك-هونيك- ساكورادا براي پيش بيني ويسكوزيته محلول به كار برده مي شوند. البته براي تعيين پارامترهاي به كار رفته در چنين مدل هايي، هنوز سنجش هاي آزمايشگاهي ضروري است. ويسكوزيته كه تعيين كننده وضعيت شارش محلول در طول فرايند قالب گيري است، براي فيلم هاي قالب- حلال از اهميت ويژه اي برخوردار است. اين عامل همچنين، يكنواختي (همديسي) صخامت فيلم را تضمين مي‌كند. براي ساخت فيلم هاي نازك بايد از محلول بالزجت كم (ويسكوزيته پائين) استفاده كرد.

 

 

 

 

فاكتور نهايي كه در انتخاب حلال اهميت دارد سميت حلال است. به خاطر طبيعت ناپايدار حلال‏ها، حلال هاي آلي بسيار قابل اشتعال بوده و بايد در هنگام به كار بردن آنها در توليد فيلم هاي قالب- حلال محتاط عمل كرد. از آنجا كه مقدار حلال باقيمانده در فيلم پليمر به صورت تعادلي است، حلال انتخاب شده بايد در سطوح غير سمي براي سلول ها نگهداري شود. تحقيقات سميت بايد بر روي فيلم هاي قالب- حلال و همچنين پليمر خالص انجام گيرد تا از عدم وجود مرگ بيش از حد سلول بر اثر حلال اطمينان پيدا كنيم.

 

 

 

 

 

با توجه به تنوع گسترده پليمرهاي موجود براي مهندسي بافت و تعداد زياد حلال ها، انتخاب تركيب مناسب مي تواند دشوار باشد. جدول 3-58 فهرستي از پليمرهاي مختلف به كار رفته در مهندسي بافت را به همراه حلال هاي معمول آنها نشان مي دهد. به طور كلي اغلب پليمرها در برخي انواع حلال هاي آلي قابل حل شدن هستند. اگر چه پلي ارتواسترها را مي توان بدون استفاده از حلال براي ساخت دستگاهها به كار برد. حلالي كه درنهايت انتخاب مي شود، بايد قابليت پاك شدن (خارج شدن) از فيلم پليمر را داشته باشد تا از ميزان سميت همزمان با تضمين قابليت مناسب قالب ريزي كاسته شود.

-قالب ريزي حلالSOLVENT CASTING                                                           

در ساخت فيلم هاي قالب- حلال معمولاً پليمر در حلالي با غلظت 30%-10 حل مي شود. مقدار غلظت بستگي به ويسكوزيته محلول نهايي و كاربرد مورد نظر فيلم قالبت- حلال دارد. غلظت پائين سبب يكنواختي ضخامت فيلم مي شود اما فيلم هاي نازك تري به دست خواهد آمد. براي به دست آوردن فيلم هاي ضخيم تر از قالب ريزي و خشك كردن مكرر استفاده مي شود. غلظت پائين همچنين زمان خشك كردن بيشتري را براي اطمينان از تبخير كافي (مناسب) حلال از فيلم طلب مي‌كند.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

براي به دست آوردن شكل مورد نظر مي توان محلول پليمر را بر روي سطح مختلفي ريخت. نوارهاي پوششي شيشه اي (Glass coverslips) و ظروف پتري وسايل متداولي هستند كه در شكل دهي فيلم هاي مسطح نازك به كار برده مي شوند. سطوح نچسب مانند تفلون را نيز مي توان براي كمك به جداسازي فيلم از قالب مورد استفاده قرار داد. سطوح ديگر ممكن است نياز به آزاد سازي شناسه داشته باشند كه مي تواند در رشد دانه هاي سلول بر روي بستر اثر بگذارد. قالب ريزي حلال را مي توان علاوه بر ساخت فيلم هاي مسطح براي شكل دهي مجاري لوله اي نيز به كار برد. در اين حالت يك ميله به درون محلول پليمر فرو برده شده و سپس خشك ميشود. معمولاً ازميله هاي شيشه اي براي اين كار استفاده مي گردد. هرچند ميله هاي پلي وينيل الكل پيشنهادي داراي مزيت حذف آب توسط انحلال بدون احتمال تغيير شكل لوله هستند. از طريق پرداخت (زدودن) يون واكنش پذير مي توان براي ساخت قالب هاي ميكروالگوهايي ( micro patterned)از جنس ويفرهاي سيليكوني استفاده كرد چنين قالب هايي را مي توان براي ساخت فيلم هايي با سطوح ميكروالگوهايي كه به طور فيزيكي رشد سلول ها را هدايت مي كنند به كار برد. (شكل 2-58).

براي شكل دهي فيلم هاي فوق نازك (5<) از پوشش دهنده چرخشي استفاده مي‏شود، (شكل 3-58). پوشش دهنده چرخشي از يك برآمدگي تشكيل شده است كه با سرعت rpm 5000-1 مي چرخد. خلاء از درون اين برآمدگي به داخل كشيده مي شود تا تضمين كننده ثبوت قالب در محل خود باشد. سرعت دوراني و شتاب و زمان چرخشي قابل كنترل هستند. زماني كه قالب در محل خود قرار گرفت و چرخش تنظيم شد، محلول پليمر درون سطح در حال چرخش ريخته شده و نيروهاي سانتريفوژ سبب پخش شدن محلول به فيلمهاي بسيار نازك با ضخامت يكنواخت مي شود. سرعت دوران، ويسكوزيته محلول و چگالي همه فاكتورهايي هستند كه ضخامت فيلم را تعيين مي كنند.

قالب گيري حلال مي تواند همچنين از مشخصه هاي خود پليمر جهت ايجاد فيلم هاي منحصر به فرد بهره ببرد. فيلم هاي ساخته شده از كوپليمرهاي بلوكي مي توانند داراي ويژگي هايي باشند كه در هوموپليمرها ديده نمي شوند. براي مثال فيلم هاي ساخته شده با پولي جي- بنزيل ال- گلوتاميت كوپليمر شده با اتيلن (PBLG-PEO) حل شده در كلروفرم مي تواند بر چسبندگي و تكثير سلول ها بر سطح تأثير بگذارند. PBLG يك پليمر آب گريز است در صورتي كه PEO آب دوست است. فيلم هاي قالب- حلال PBLG-PEO داري ساختار هايي جدا از هم ميكروفازي هستند كه متناسب با مقدار PEO بر چسبندگي سلول اثر ميگذارد. فيلم هاي لانگ موئير- بلوجت به وسيله قرار دادن محلول پليمر بر لايه آب ساخته مي شوند. در اين نوع فيلم، كوپليمر بلوكي خودش را به نحوي به صورت تك لايه رديف مي‌كند كه انتهاي PEO به سمت آب و PBLG به سمت خارج باشد. سپس فيلم ها را مي توان از سطح آب به هر بستر مناسب ديگر منتقل كرد. چنين فيلم هايي از يك طرف اجازه چسبندگي سلولي را داده و از طرف ديگر ممانعت مي كنند.

بعد از ريخته شدن محلول به فيلم اجازه مي دهيم تا خشك شود. در ابتدا، حلال از محلول با نرخ تحميل شده توسط نقطه تبخير حلال خالص، بخار مي شود. بعد از اينكه فيلم به صورت ژل در آمد، تبخير توسط انتشار حلال از ميان ماتريس پليمر محدود مي شود. زمان خشك شدن متناسب با صخامت فيلم و نقطه تبخير حلال تغيير مي‌كند. حذف اضافي حلال با قرار دادن فيلم در خلاء انجام مي شود. به طور كلي، فيلم قبل از قرارگرفتن در خلاء بايد در فشار معمولي تا زمان سخت شدن خشك شود.

خلاء بايد به تدريج كاهش يابد تا از تبخير ناگهاني حلال باقيمانده درون ماتريس پليمر جلوگيري كند. اين وضعيت مي تواند منجر به تغيير شكل فيلم به صورت حفره هاي بزرگ شود (شكل 4-58). به طور كلي بايد فيلم فرصت داشته باشد تا براي 6 الي 8 ساعت خشك شده و سپس به مدت 24 ساعت تحت خلاء قرار گيرد تا از خارج شدن كامل حلال اطمينان حاصل شود.

 

 

 

 

 

 

با خارج شدن فيلم خشك شده از قالب فيلم آماده استفاده خواهد بود. براي به دست آوردن شكل نهايي شايد نياز به پردازش هاي اضافي نيز باشد. فيلم را مي توان به شكل متفاوت يا حتي به فرم حلقه (رل) و به صورت مجراهاي لوله اي درآورد. همچنين سطح را مي توان جهت ارتقاء چسندگي سلول يا تكثير سلولي توسط فاكتورهاي مختلف اصلاح كرد.

-تحليل سطحSURFACE ANAYSIS                                                                       فيلم هاي قالب- حلال مهندسي بافت با در آميختن فاكتورهاي مختلف در سطح به چسبندگي سلول يا ارتقاء رشد سلولي كمك مي‌كند. روش هاي تحليلي متنوعي براي تشريح سطح اين فيلم ها توسعه يافته اند. در ابتدا، از روش ميكروسكوپي نوري و اسكن الكتروني مي توان براي تشريح توپولوژي سطح به روش معمول بررسي بصري استفاده كرد. شيوه هاي پيشرفته تري نيز براي تعيين جزئيات توپوگرافي و ارزيابي توده و تركيب شيميايي سطح فيلم وجود دارد.

ميكروسكوپي نيروي اتمي (AFM) را مي توان براي ارزيابي غير مخرب توپوگرافي سطح فيلم به كار برد. در AFM، نور ليزر از يك بازوي ستوني كه در پاسخ به تغييرات تراز سطح فيلم حركت مي‌كند منعكس مي شود. قدرت تفكيك در اين وسيله درحدود nm1/0 است. عمل اسكن اين بازو بر روي سطح ممكن است در صورت بر هم كنش نوك (رأس) شي با مولكولهاي ضعيف مهار شده سطحي سبب تغيير شكل اشياء نرم شود.

اطلاعات شيميايي در مورد ساختار مولكولي ماده توده فيلم از طريق طيف نگاري تبديل فوريه انعكاس كلي تضعيف شده مادون قرمز (ATR-FTIR) كه مبتني بر نوارهاي ارتعاشي واحدهاي باند شده است، به دست مي آيد. تركيبات سطح با استفاده از طيف نگاري الكترون براي تحليل شيميايي (ESCA) يا طيف نگاري فوتوالكترون اشعه (XPS)X و طيف سنجي ثانويه توده يوني (SIMS) ارزيابي مي شود. ESCA مي تواند تا عمق A⁰ 100 سطح را آناليز كند، در حاليكه SIMS تنها به عمق A⁰ 15-10 مي رسد. ESCA از پرتوهاي X فرودي براي آزاد كردن الكترون هاي تراز هسته كه به وسيله تحليل گر طيف انرژي شناسائي مي شوند استفاده مي‌كند. اين روش مي تواند براي بررسي ديناميك هاي سطح پليمر و پويايي (ديناميك) پروتئين رونشين استفاده شود. SIMS را مي توان براي تكميل اطلاعات به دست آمده از ESCA به كار برد. از تركيب SIMS با طيف شيميايي مي توان جهت تعيين گونه هاي شيميايي حتي پروتئين رونشين شده (جمع شده) بر سطوح فيلم استفاده كرد.

از سنجش هاي زاويه تماس(contact angle) مي توان براي تعيين قابليت خيس شوندگي سطح فيلم بهره برد. هنگامي كه يك قطره مايع با سطح فيلم در تماس بوده و با رطوبت اطراف در تعادل باشد زاويه بين سطحي مايع- گاز و بين سطحي مايع- جامد را مي توان براي تعيين انرژي سطح به كار برد. انرژي سطح نشان دهنده قطبيت گروههاي عملياتي در ارتفاع A⁰ 10-2 است. آب گريزي يا آب دوستي سطح فيلم در تعيين بر هم كنش هاي سلولي با سطح فيلم اهميت دارند.

اين روش ها ابزار آلات ارزشمندي را طلب مي‌كند تا كاربرد فيلم هاي قالب- حلال را به منظور ساختارهاي پشتيبان براي بافت ها ارزيابي كند. در تفسير نتايج بايد دقت كافي مبذول داشت زيرا شيوه هاي متفاوت در محيط هايي كه بسيار نامشابه با شرايط بيولوژيكي مي باشند صورت مي گيرند. براي مثال ESCA و SIMS تحت شرايط خلاء بسيار زياد، انجام مي شود كه سبب باقي ماندن حلال درون فيلم مي گردد. با اين وجود شيوه هاي بسيار متنوعي براي توصيف سطح وجود دارد كه هر كدام بايد با جزئيات ارزيابي گردد تا مناسبت آناليز فيلم هاي قالب- حلال را مشخص نمايد.

-چكيده

قالب ريزي حلال يك روش ساده و ارزان است كه به منظور توليد بستر هايي براي كاربردهاي مهندسي بافت به كار گرفته مي شود. حلال هاي بي شماري براي حل كردن پليمرها در دسترس هستند اما در انتخاب حلال بايد دقت داشت تا در زمان حذف (خارج سازي) هر گونه اثر سمي از سلول هاي كاشته شده، پايداري پليمر حفظ شود. اين شيوه اجازه شكل گيري اشكال ساده مانند صفحات تخت و لوله ها با قابليت ورقه ورقه شدن، شستن (پالايش) ذره اي و قالب ريزي دوار براي تهيه ساختار پيچيده تر را مي دهد. همچنين از آنجا كه قالب ريزي در دماي اتاق انجام مي گيرد در اثر فشار قالب ريزي و بيرون زدن، تخريب القايي گرما براي پليمر رخ نمي دهد. هنگامي كه فيلم ها ساخته شدند روش هاي تحليلي مختلفي مانند ESCA و SIMS و سنجش هاي زاويه تماس را مي توان جهت تشريح ساختار پليمر همچنين مواد رونشين شده (جمع شده) بر سطح بستر به كار برد.

 

اين تفاوت ها در مقتضيات قانون ها به برخي ازدرمان هاي خاص اجازه داده است كه بدون مطالعات اثر گذاري به سرعت به بازار راه يابند. در نمونه هاي انتخاب شده، عملكرد باليني اين درمان ها بسيار ناميد كننده و ناهمسان بوده است. بنابراين، پزشكان باليني، و بيماران بايد بدانند كه در دسترس بودن درمان مهندسي بافت ضمانتي بر كارآيي آن نيست. همانند محصولات مصرفي ديگر، مسئوليت نهايي بر عهده خريدار است تا قبل از انتخاب و تجويز درمان مهندسي بافت به قول معروف چشم و گوش خود را باز كند.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

توليد داربست هاي پليمري: لايه سازي غشاء

لايه سازي غشاء براي درمان سلول هاي كپسوله شدن براي رهايش دامنه گسترده اي از محصولات به دست آمده از مولكول هاي كوچك (براي مثال، دوپامين، انكفالين‏ها) تا محصولاتي با ژن هاي بسيار بزرگ (مانند فاكتورهاي رشد، ايميونوگلوبولين ها (گلوبولين هاي ايمني)) را در بر مي گيرد. بسياري از بيماري ها درمدل هاي حيواني كوچك و بزرگ و موارد انساني مطالعه شده اند. اهداف بيماري شامل از كار افتادگي كبد، ديابت نوع I ، درد مزمن، آلزايمر، اسكلروزه شدن سلول هاي عصبي مسئول حركت عضلات (amyotrophic lateral sclerosia)، كره هنگينگتون (Huntington’s chorea) و بيماري پاركينسون است. كليه دستگاهها داراي سطوحي از ايمني سلولهاي بيگانه زا ياد گرزا (زنوژنيك يا آلوژنيك) هستند. اولين دستگاهي كه در حال دريافت تأئيديه در ايالت متحده است دستگاهي به نام «كبديار» است (liver assist) (به عبارت ديگر، كاشت يك پل(bridge )در كبد) نكات كليدي در استفاده از مواد جهت ساخت اين دستگاهها عبارتند از: 1- غشاء زيست سازگار، اجزاء دستگاه و مواد ماتريس 2- كاشتني هاي مستحكم و 3- موادي كه قابليت تبديل به غشاهايي با ويژگي هاي مناسب كاشت را داشته باشند. اين فصل بر روش هاي تأثير گذار بر غشا يا سنجش توان آن و خصوصيات كاشت تأكيد مي‌كند. هر دو اين خصوصيات براي هر سيستم تجاري كاشت حياتي خواهد بود. خصوصيات كاشت غشا براي همه سيستم ها بحراني است چه دستگاه كاشتني باشد وچه خارج بدني. شيوه هاي ساخت غشا مي توانند غشاءهايي با قدرت دو تا چهار برابر قدرت غشاء هاي معكوس فاز سنتي تهيه كنند. با استفاده از ابزار آلات جديد سنجش وزن هاي ملكولي كوچك و بزرگ مي توان غشاهايي با تركيبات ايزولاسيون ايمني و نرخ رهايش دلخواه را براي كاربردهاي بي شماري تهيه ديد كه بالقوه پرگستره و سيعي از درمان بيماري اثر مي گذارند.

پشگفتار

يك حوزه مهم براي بيوموادها، رهايش مواد فعال در مناطق خاصي از بدن (invivo) است. به طور سنتي اين حوزه توسط كپسول هاي پليمري تخريب پذير و غيره تخريب پذير كه شامل يك يا چند دارو هستند احاطه شده است. در اين حوزه مواد در حين ساخت با يك ماتريس پليمري تركيب شده و سپس بعد از مدت زماني از ميان ماده يا در خلال تخريب ماده آزاد مي شوند. در اينجا كنترل مناسب كنتيك هاي آزاد شده از اهميت خاصي برخوردار است. يك مثال در اين مورد كنتيك هاي رها شده مرتبه صفر به دست آمده از ميله هاي كوپليمر استات اتيلن- ونيل (EVAc) به كار رفته در رهايش عاملهاي شيمي درماني در مغز است. در طول دو دهه پيش محققان تلاش كرده اند كه مواد را از ناقل هاي رهايش هيبريدي زيست مصنوعي (bioartificial) كه شامل لايه هاي غشا بر سطح اجزا سلولي كپسوله شده كه درون غشا هستند آزاد كنند، (به عبارت ديگر درمان غشاء كپسوله شده سلول).

هدف از تحقيقات درمان غشاء كپسوله شده سلول توسعه كاشتني هاي حاوي سلول هاي زنده بيگانه زا يا دگر زا براي درمان شرايط وخيم و ناتواني هاي انساني است. برداشت از توانايي عبارت است از سلولها يا توده هاي كوچك بافت كه توسط لايه غشا انتخابي احاطه مي شوند و اجازه عبور آزادانه اكسيژن و ديگر احتياجات متابوليسمي همراه با آزاد سازي ترشحات سلولي زيست فعال را مي دهند اما از عبور عامل هاي سمي بزرگ تر سيستم ايمني دفاعي بدن جلوگيري مي كنند.

كاربردهاي اصلي و هدف از درمان سلول كپسوله شده عبارتند از : درد مزمن، بيماري پاركينسون و ديابت نوع I ، همچنين ناتواني هاي ديگر ناشي از افت ترشح عملكرد سلول كه با كاشت اندام يا درمان هاي دارويي به طور كامل قابل مداوا نيستند. علاوه بر اين شرايطي كه بالقوه قابليت پاسخ دهي به حفظ رهايش موضعي فاكتورهاي رشد و ديگر تصحيح كننده هاي پاسخ بيولوژيك را داشته باشند با اين روش بررسي شده اند. گونه هاي متضاد درمان سلول هاي ايزوله شده ايمني در مدل هاي كوچك و بزرگ حيواني و انساني شامل درد مزمن، بيماري پاركينسون، ديابت نوع I، و از كار افتادگي وخيم كبد (خارج بدني) و در چندين گروه از مدل هاي حيواني كره هتگينكتون، هموفيلي، بيماري آلزايمر، اسكلروزه شدن سلول هاي عصبي مسئول حركت عضلات و صرع مي باشند. از اين ميان به نظر مي رسد كه از كار افتادگي وخيم كبد اولين درماني باشد كه براي استفاده تجاري در انسان تأئيد مي شود.

كپسوله كردن بافت عموماً به دو شكل انجام مي گيرد: لايه بندي غشاء ميكروكپسوله و ماكرومتخلخل (درون عروقي و برون عروقي) در ميكروكپسوله سازي يك يا چند سلول با پراكندگي هاي كروي فراوان (با قطر 100-300nm) كپسوله مي شوند. در ماكروكپسوله سازي تعداد زيادي از سلول ها يا توده هاي سلولي در يك يا چند كپسول نسبتاً بزرگ كاشته مي شوند. (براي فيبرهاي توخالي، ابعاد معمول 0.5-6nm) قطر، با طول كلي 0.5-10cm) مزاياي روش ‎آخر عبارت است از پايداري شيميايي و مكانيكي و سادگي بازيافت در صورت نياز يا خطر.

-روابط خصوصيات ساختاري براي پليمرهاي به كار رفته در لايه بندي غشاء

ثابت بودن خصويات غشاء انتخاب شده و ماده غشاء درطول زمان اهميت زيادي دارد. تخريب غشاء شامل تغيير خصوصيات فيزيكي و ويژگي هاي انتقالي در طول زمان ميشود كه به دليل بر هم كنش با محيط داخل بدن ميباشد. خصوصيات اصلي كه قابل تغيير هستند، اندازه خلل و فرج (و توزيع سراسري اندازه خلل و فرج) و ضرائب پخشندگي انتقال توده مي باشند.

دامنه وسيعي از مواد غشاء را مي توان براي اندام هاي مصنوعي از اين نوع به كار برد. يكي از پر استفاده ترين مواد براي اين كاربرد، پلي اكريلونيتريل- كوپليمر شده با- ونيل كلرايد [P(AN-VC)] است. P(AN-VC) يك كوپليمر آماري
 (statistical copolymer)ساخته شده از مونومرهاي نيتريل و ونيل كلرايد است كه در بسياري از مطالعات لايه سازي غشاء سلول به كار رفته است. كانديدهاي ديگر عبارتند از، پلي اكريلونيتريل (PAN)، پلي سولفون (PS)، پلي اتر سولفون (PES) پلي ونپليدين دي فلورايد (PVDF)، پلي آميدها (PA)، پلي كربنات (PC)، پلي اتر ايمايدها (PEI) پلي پروپيلن (PP)، و پلي اتيلن (PE). علاوه بر اين مواد ساخته شده از پليمرهاي متعارف غشاها از ساختارهاي كامپوزيت تهيه مي شوند . از جمله غشاهاي ساخته شده از (پلي اكريلونيتريل- كوپليمر شده با ونيل كلرايد)- (پلي اكسيداتيلن).

ساختار فيزيكي غشاهاي به كار رفته در لايه هاي غشاء به وسيله شرايط متابوليكي سلول هاي كپسوله شده ،اندازه مواد درماني آزاد شده، درجه حفاظت ايمني مورد نياز، و زيست سازگاري مناسب بافت تعيين مي شود. مهم ترين خصيصه انتقالي غشاها به وسيله شرايط متابوليكي سلول كپسوله شده تعيين مي گردد. غشا بايد داراي گذرگاههاي كافي مواد غذايي براي سلولهاي كپسوله شده باشد تا آنها را زنده و فعال حفظ كند. همچنين در ضمن حفظ عملكرد سلول ها ،غشاء بايد داراي خلل و فرج هايي مناسب براي عبور آزادانه عامل هاي درماني به محل هدف باشد. اگر سلول هاي كپسوله شده نياز به حفاظت ايمني داشته باشند، غشاء بايد از ورود عناصر ايمونولوژيكي (Immunological) به درون كپسول جلوگيري كند. علاوه بر اين، شكل (مورفولوژي) غشاء تأثير شديدي بر زيست سازگاري در حد فاصل غشاء- ميزبان خواهد داشت. خصوصيات انتقالي و شكل (مورفولوژي) خارجي را مي توان توسط روش هايي كه بعداً ذكر مي شوند دستكاري كرد، (تغيير داد).

غشاهاي نيمه تراوا به طور گسترده در مطالعات ماكروكپسوله سازي سلول هاي مترشحه انسولين براي درمان ديابت نوع I به كار برده مي شوند. غشاءهاي نيمه تراواي وارونگي فاز، با استفاده از پليمر P(AN-VC) به كار رفته در كپسوله سازي سلول هاي مترشحه انسولين ساخته مي شوند. روش به كار رفته توسط اين دسته شامل جايگزيني جزاير لانگرهانس است كه حاوي سلول هاي  مترشحه انسولين در يك غشاء فيبري توخالي است كه اجازه ترشح انسولين از طريق تحريك گلوكوزي در ضمن حفظ زيست پذيري (حيات) سلول توسط انتشار اكسيژن و مواد غذايي به درون كاشتني را مي دهد.

روش هايي مشابه كپسوله كردن سلول هاي مترشحه انسولين وجود دارند كه از غشاء هاي ميكرومتخلخل ساخته شده از پلي اورتان (PU) و پلي 2 هيدروكسي اتيل متاكريلات (PHEMA) استفاده مي كنند. در غشاء PU    با حل كردن يك شكل دهنده، خلل و فرج حبس شده تشكيل مي شود، در صورتي كه غشاء PHEMA توسط عاملهاي شبكه ساز ايجاد مي شود.

لايه سازي غشاء بر روي جزاير لانگرهانس همچنين در تجهيزات درون شرياني درون كاشت و برون كاشت بررسي شده است. با وجود اينكه اساس چنين سيستم هايي هنوز بر مبناي انتشار است اما اجزاء پيوندي هنوز وجود دارند. در طراحي اين دستگاهها سلول ها در اطراف غشاء قرار گرفته و خون از ميان مجراي غشاء عبور مي‌كند. چيك و همكارانش مطالعاتي را بر روي كوپليمر (AN-VC)P در فيبرهاي چند گانه غضروفي انجام داده اند. مواد غشائي ديگر مانند غشاهاي PS نيمه تراوا نيز توسط سان و همكارانش ارزيابي شده است. سگا و همكارانش از دستگاههاي فيبري چند گانه ساخته شده از پلي ونيل الكل (PVA) جهت ميكروكپسوله كردن سلول هاي مترشحه انسولين استفاده كردند.

سوليوان و همكارانش با استفاده از روش مشابهي، از يك غشاء دهانه بزرگ منفرد درون پانكراس مصنوعي قابل كاشت كه خون از ميان آن عبور مي‌كرد استفاده كردند. دستگاههاي تك فيبره ساخته شده از غشاكهاي نيمه تراواي PA نيز توسط كاتاپانو و همكارانش در اين سيستم به كار گرفته شدند.

علاوه بر جزاير لانگرهانس سلول هاي غدد درون ريز نيز به وسيله غشاهاي حفاظتي ايمني (AN-Ve)P در طرح درماني پركاري تيروئيد تحت بررسي قرار گرفتند. كريستنسون و همكارانش كمبود ايمني غده تيموس را با غشاء مشابهي ارزيابي كردند.

بافت همبند (رشته اي) ميكرومتخلخل PS، در هنگام كاشته شدن با هپاتوسيت ها به شكل تجهيزات فوق بدني (مادي) به عنوان دستگاه كبديار به كار گرفته مي شود. خون هپارين زده به دورن غضروف پمپ مي شود تا خروج متابوليت هاي مضر را تسريع كند. اين دستگاه به زودي توسط سازمان غذا و دارو (اداره خوراك و دارو) براي فروش به عنوان پل كاشتني كبد تأئيد مي شود. همچنين براي درمان نقص (كمبود) رشد و تسكين دردهاي مزمن از ميكروكپسوله ها استفاده مي شود.

لايه سازي سلول هاي غشا براي درمان بيماري هاي مختل كننده سيستم عصبي مانند پاركينسون در گروه جوندگان و ميمون ها توسط آئبيشر و همكارانش بررسي شده است. آنها از P(AN-VC) به عنوان ماده غشاء استفاده كردند. كپسوله كردن و كاشت سلول هايي كه از خود فاكتور رشد عصبي (NGF) ترشح مي كنند توسط هوف من و همكارانش و وين و همكارانش بررسي شد. وي بقاي نرون هاي بازال كولينرژيك مغز قدامي قوس هاي لبه اي صدمه ديده مشو را ثابت كرد. ناتواني حافظه دريادگيري در بيماري آلزايمر نتيجه از دست رفتن (اختلال) اين نرون هاست.

-فرايند لايه سازي غشاء         MEMBRANE LAMINATION PROCESSING  

وارونگي فاز                                                          PHASE INVERSION              

اكثريت غشاهاي ميكروپالايش (MF) و فراپالايش (UF) ترموپلاستيك جهت كپسوله كردن سلول ها از طريق وارونگي فاز محلول پليمر همگن ساخته مي شوند. غشاهاي فراپالايش داراي خلل و فرج هايي با اندازه هايي در حدود nm5 تا 1/0 هستند در حالي كه غشاهاي ميكروپالايش (يا ميكرومتخلخل) داراي خلل و فرج هايي در محدوده 5/0 تا 3 هستند. وارونگي فاز يك روش چند جنبه اي است، كه اجازه شكل گيري غشاهايي با حدود گذردهي، مورفولوژي و جرم مولكولي نامي بسيار وسيع را مي دهد. مورفولوژي و خصوصيات غشاء بستگي به پارامترهاي ترموديناميك و كينتيك هاي فرايند دارد. پليمر در يك حلال مناسب حل مي شود. سپس محلول به صورت يك صفحه تخت يا يك فيبر توخالي (پوك) برجسته قالبگيري مي شود. به عنوان قسمتي از فرايند ريخته گري يا برجسته سازي، محلول پليمر توسط انتقال فاز كه با تغيير دما يا تركيبات محلول صورت مي گيرد، ته نشين مي شود. اين فرايند شامل انتقال يك محلول پليمر مايع تك فاز به يك سيستم دو فاز مي شود كه از يك فاز غني از پليمر كه ساختار غشاء را شكل مي دهد و يك فاز ثانويه مايع فقير از پليمر كه خلل و فرج هاي غشاء را شكل مي دهد تشكيل مي شود. هر پليمري كه بتواند يك محلول همگن تشكيل دهد كه تحت دما و تركيبات خاص به دو فاز تفكيك شود، در اين فرايند قابل استفاده است. پارامترهاي ترموديناميك و كنتيك (جنبشي) مانند پتانسيل شيميايي اجزا و انرژي آزاد تركيب اجزاء، وضعيتي را كه در آن تفكيك فازي رخ مي دهد تعيين مي‌كند. اين فرايند با نمودار فاز سه متغيره پليمر حلال غير حلال قابل توصيف است.

-وارونگي فاز انعقاد گرمايي (ژل سازي گرمايي)

 THERMAL GELATION PHASE INVERSION                                           

فرايند وارونگي فاز القاي گرمايي از پليمر حل شده در دماي بالا در يك حلال بالقوه (نهفته) (حلالي كه براي يك پليمر خاص در دماي پائين از خود حلاليت كمي نشان مي دهد) استفاده مي‌كند كه به خاطر ضعف توان حلال دردماي پائين در زمان سرد شدن يك محلول ژلاتيني توليد مي‌كند. سپس بايد با استفاده از يك سيال ديگر كه حلال بالقوه را در خود حل مي‌كند و براي پليمر غير حلال است، حلال هاي بالقوه غير متغير را از ژل خارج كرد. فرايند انعقاد گرمايي قابليت توليدساختارهاي فراپالايش يا ميكرو پالايش متقارن يا نامتقارن را دارد.

-ته نشيني القايي انتشارDIFFUSION – INDUCED PRECIPITATION          ته نشيني بر مبناي انتشار نياز به حذف حلال دارد كه منجر به حل نشدن پليمر مي شود. در يك روش، حلالي كه پليمر درآن حل مي شود در اثر تماس با بخار غير حلال، تبخير، يا فرو رفتن كامل در حمام غير حلال خارج مي شود. تبخير يك حلال متغير با غشاء قالبگيري شده، يك ساختار همگن چگال ايجاد مي‌كند. شيوه هاي بخار يا فرورفتن كامل، به انتشار غير حلال درون محلول بستگي دارد كه به واسطه كاهش حلاليت سبب ته نشيني پليمر مي گردد.

-پس رفتارهاي فيلم هاي چگاليPOST-TREATMENTS OF DENSE FILMS     برخي از انواع خاص غشاهاي MF توسط كشش مكانيكي يا زدودن (پرداخت) شيميايي فيلم هاي چگال تهيه مي شود. براي مثال غشاهاي پلي تترا فلورواتيلن با قرار دادن فيلم تحت تنش كششي تهيه مي شود. غشاهاي پلي كربنات توسط فرايند زدودن مسير تهيه مي گردند. غشاهايي كه براي ماكروكپسوله سازي ارزيابي مي شوند. عموماً از نوع MF يا UF هستند. يك غشاء UF بر اساس نوع غشا به گونه هايي با جرم مولكولي در حدود 300000-300 مشخص مي شود. كاشت اكثر سلول هاي زنوگرافت (xenograft) به غشا UF نيازمند است، در حالي كه سلول هاي آلوگرافت (allograft) يا داراي امتياز ايمني (Immunoprivileged) به طور موفقيت آميزي در غشاهاي درجه MF كه گونه ها را در محدوده nm10-1/0 نگه مي دارد كپسوله شده و به تنهايي از تماس سلول كاشته شده با سلول ميزبان جلوگيري مي‌كند.

خصوصيات غشاء                                                           MEMBRANE PROPERTIES

قدرت (توان)                                                                 STRENGTH

كشساني (ارتجاع) يك وسيله پزشكي در محيط داخل بدن نهايتاً سبب محدود شدن نتيجه مطلوب مي گردد. طراحي تركيب نهايي يك وسيله، ميزان توان مورد نياز غشاء را مشخص ميكند. بايد توجه داشت كه، توان غشا به طور كلي با جابجايي انتشاري در سري هاي مشابه نسبت معكوس دارد. غشاء همچنين بايد داراي چند درجه انعطاف پذيري باشد تا در حين كاشت و بازيافت سالم باقي بماند. اگر اجزاء ديگر وسيله به عنوان عضو محتمل توان مورد استفاده قرار گيرد، گزينه ساختار غشاء، ابعاد، تركيب و مواد به آنهايي كه سبب بهينه شدن خصوصيات انتقالي مي شوند، محدود مي گردد.

اگر توان غشاء به خاطر توان كلي دستگاه محدود گردد، غشاء بايد با ملاحظات خاصي از جمله تغيير ابعاد، تركيبات و ساختار غشاء براي افزايش توان ساخته شود. انتخاب ماده اي ذاتاً مستحكم تر (به عبارت ديگر با قوام تر) يا با وزن مولكولي بالاتر كه غشاء باآن قالب گيري مي شود بايد باعث افزايش كلي خصوصيات مكانيكي شود. غشاهاي UF يا MF را ميتوان با ايجاد ميكروحفره هايي درون ديواره يا به شكل ابر باز سلولي(open cell foam) با ميكروحفره هاي متصل به هم ساخت. با تلفيق روش هايي كه سبب افزايش ساختار شبكه اي همگن درون ديواره غشا مي شود مي توان توان كششي را افزايش داد. همچنين با زياد شدن سطح مقطع غشاء به واسطه ضخيم كردن ديواره ها مي توان توان را نيز افزايش داد. كاهش تخلخل كلي غشاء سبب بالا رفتن توان سرتاسري غشاء مي شود. مثال هايي كه شامل ساختارهاي ماكروحفره اي و شبكه اي همگن هستند به ترتيب در شكل هاي 1-59 و2-59 آورده شده است.

مورفولوژي (شكل) خارجي غشاها در طول ساخت يا در اثر پس رفتارهايي كه براي اصلاح عكس العمل مطلوب براي يك كاشتن موفق صورت مي گيرد، تغيير مي‌كند. با استفاده از روش هاي مختلف وارونگي فاز سطح خارجي غشا مي تواند از پوست پس زده شده تا ساختارهايي كه براي ورود به سلولها به داخل ديواره (با قطر تقريبي 10) به اندازه كافي بزرگ هستند، گسترش يابد، تركيب مناسب انتقال غشا و مورفولوژي هاي ديگر نيز با استفاده از غشاهاي كامپوزيت قابل تهيه است. باگز و همكارانش از چنين غشاهايي براي درمان ديابت نوع I استفاده كردند.

 

 

 

 

 

 

 

مشخصه هاي انتقالTRANSPORT CHARACTRISTIC                                  

بسياري از سنجش هاي متفاوت انتقال شامل گذردهي هيدروليك، پس زني ماده حل شده و ضريب پراكندگي را مي توان براي تعيين مشخصه هاي پديده شناسي انتقال غشاء كپسوله شده به كار برد. نفوذ پذيري هيدروليك و پس زني ماده حل شده به فرايندهاي همرفتي بستگي پيدا مي‌كند. كه در آنها حركت توده سيال از طريق اختلاف فشار فراغشايي به دست مي آيد. اين مقاومت هاي همرفت براي آب و جريان ماده حل شده به ترتيب از طريق اندازه گيري نفوذپذيري هيدروليك و پس زني ماده حل شده به دست مي آيد. انتشار فرايندي است كه توسط آن مولكول ها به واسطه گراديانهاي غلظت به جنبش درآمده و با حركت «بروني» از منطقه با غلظت زياد به منطقه با غلظت كم جابجا مي شوند. اندازه گيري خصوصيات انتشاري و همرفت غشاء كپسوله شده نشانگر ظرفيت حفظ ايزولاسيون ايمني است.

-روش هاي همرفت                                                                  Convective Techniques

نفوذ پذيري هيدروليك (HP) يك غشا از طريق شارش همرفت آب در يك فشار فراغشايي ثابت معين مي گردد. نفوذپذيري هيدروليك با ملاحظه سطح منطقه در معرض و فشار فراغشايي نرماليزه مي شود كه منجر به ايجاد واحدهاي شار- سطح- فشار مي گردد. محدوده غشاهاي همودياليز امروزي در نفوذپذيري هيدروليك از ml/[hm²mmHg] 6-2 براي غشااي كم شار و ml/[hm²mmHg] 200-10 براي غشاهاي پرشار است. اين پارامتر عملياتي كه با درصد خلل و فرج‏هاي سطح كه به طور پيوسته در ديواره غشا وجود دارند متناسب است، از اندازه خلل و فرج و توزيع اندازه خلل و فرج ها ميانگين گرفته و آنها را در يك پارامتر نشان مي دهد. سنجش هاي آزمايشگاهي را ميتوان با شارش هاي نظري محاسبه شده از معادلات هاگن- پسيلي مقايسه كرد.

در حالي كه  = شارش حجمي آب (m³/s)، n= تعداد خلل و فرج ها (بدون واحد(بعد))  = ويسكوزيته (Kg/[m.s])، r= شعاع خلل و فرج, (m)= پيچيدگي (انحنا) (بدون بعد)، l= ضخامت غشا (m) و  اختلاف فشار در طول غشاء (N\m²) مي باشند. ضخامت لايه پوست براي فراپالايش نامتقارن غشاء پلي فنيلين اكسيد (PPO) با استفاده از محلول ذرات كلوئيدي طلا سنجيده شده و توزيع اندازه خلل و فرج هاي باز توسط روش پرم پورومتري تعيين مي شود. با فرض پيچيدگي (انحنا) 1 در معادله (1) شارش آب براي غشاهاي PPO محاسبه مي شود كه با مقادير اندازه گيري شده همخواني دارد. مقايسه شارش نظري و اندازه گيري شده آب خالص نشان دهنده وابستگي پارامترهاي مورفولوژيكي غشاء به دست آمده از روش پرم پورومتري و روش ذرات كلوئيدي طلا به خصوصيات انتقال غشاء است.

 در بررسي هاي ثانويه شعاع خلل و فرج ها براي نمايش نكلئوپور بر مبناي سنجش شار محاسبه شد. محاسبات به دست آمده براي تخمين ضخامت هيدورديناميك دكستران روشين شده (قابل صرفنظر) پلي اتيلن اكسيد (PEO) (nm7-6) و پلي ونيل پيروليدون (PVP) (nm6-3) به عنوان ردياب در آزمايشات انتشار به كار مي رود.

اندازه خلل و فرج غشا را مي توان با تعيين نرخ فراپالايش شار نيز ارزيابي كرد. شار فراپالايشي  به صورت نسبت شار حجمي  بر واحد سطح غشاء A مطابق معادله ذيل تعريف مي شود.

(2)

نرخ حذف ماده حل شده M عبارت است از:

(3)

جائي كه  غلظت ماده حل شده فراپالايشي است. غلظت ماده حل شده فراپالايشي به غلظت توده نگهداري شده  در ضريب پالايش مشاهده شده S بستگي دارد.

(4)

البته در برخي متن ها ضريب پس زني ماده حل شده R به كار برده مي شود.

(5)

از تركيب معادلات (2) تا (5) مي توان ارتباط شار ماده حل شده را با شار فراپالايشي و ضريب پالايش مشاهده شده به شكل زير درآورد.

(6)

بنابراين با داشتن شار فراپالايشي غلظت توده حل شده و ضريب پس زني غشا براي ماده حل شده مي توان شارش ماده حل شده در ميان غشا را محاسبه كرد.

محدوده اندازه هاي ماده حل شده نشان دهنده پروفيل (نماي) ضريب پس زني غشاء است. اين پروفيلهاي را مي توان توسط برش نامي وزن مولكولي (nMWCO) كه نشان دهنده اندازه متوسط خلل و فرج است، به دست آورد. در حالي كه شيب منحني نشان دهنده توزيع اندازه خلل و فرج مي باشد.

پلاريزاسيون غلظت ايجاد شده به وسيله آرايش لايه مرزي در طول سنجش پس زني مي تواند اثر شديدي بر منحني هاي پس زني اندازه گيري شده داشته باشد. براي به دست آوردن پروفيل خهاي پس زني كه به جاي اثرات هيدروديناميك نشان دهنده خصوصيات غشاء هستند بايد شرايط عملياتي شارش بر مبناي هندسه فيبركنترل شود. اين كار شامل تنظيم نرخ هاي جريان لومينار جهت ايجاد مجموعه اي از نرخ هاي برشي و تنظيم شار نفوذي براي كمينه كردن پليرازاسيون غلظت مي شود.

مواد حل شده متداول در توليد منحني هاي پس زني شامل پروتئين هاي گلوبولي (آلبومين سرم گاوي (BSA)،  MW=67KDa؛ IgG ، اوال بومين، MW59Kda ؛ و ميوگلوبين ، MW 16Kda [ و پولي ساكاريد ها مانند دكسترال و فيكول هستند. اين محلول ها را مي توان به تنهايي يا به صورت تركيبي از ردياب هايي با اندازه هاي مختلف تهيه كرد. سيستم هاي تشخيص پروتئين شامل اسپكترومتري (طيف سنجي) براي محلول هاي تك جزئي و كروماتوگرافي
(size exclusion chromatography)اندازه مجاز تزويج شده با طيف سنجي UV براي تركيبات پروتئين مي باشند. براي بالا بردن حساسيت، آنزيم هايي مانند لاكتيت دهيدروژناز، يا پيروات كيناز را مي توان با آزمون هاي آنزيمي مربوطه يا پروتئين نشان دار فلورسئين تزويج شده با شناساننده هاي فورسنانس مورد استفاده قرار داد.

از محلول هاي دكستران چند طيفي ( 2000000-2000) معمولاً براي ايجاد منحني هاي پس زني غشاء استفاده مي شود. كروماتوگرافي اندازه مجاز به همراه شناساننده‏هاي ضريب شكست براي تحليل غلظت هاي پالايشي و انباشته شده (ذخيره اي) به شكل تابعي از وزن مولكولي به كار گرفته مي شود و دكستران هاي نشان دار فلوروسئين باشنا شناساننده هاي ضريب شكست براي تحليل غلظت هاي پالايشي و انباشته شده (ذخيره‌اي) به شكل تابعي از وزن مولكولي به كار گرفته مي شود و دكستران هاي نشان دار فلورسئين با شناساننده هاي فلورسانس براي افزايش حساسيت قابل استفاده هستند. خطاي ذاتي ايجاد شده در غشاء منحني هاي پس زني پروتئين با بكارگيري محلول هاي دكستران كه داراي قابليت باندشدن كمي با اكثر ساختارهاي غشاء پليمري هستند، به حداقل مي رسد. تأثير رونشيني پروتئين بر بسته شدن خلل براي غشاء پلي سولفون و پلي اتر سولفون ثابت شده است. اين و همكارانش كاهش MWCO از KDa40 به KDa14 را پس از قرار گرفتن در معرض محلول BSA كه در برابر كاهش اندازه خلل و فرج در اثر رونشيني پروتئين ثابت باقي مي ماند را نشان دادند. مقايسه اي ميان منحني هاي پس زني دكستران و پروتئين بر اساس اندازه ماده حل شده نشان دهنده هماهنگي خوب براي منحني BSA اضافه شده به دكستران است.

-روش هاي انتشاري

آزمون تشريح MWCO همرفت، اطلاعاتي را در مورد خصوصيات پالايشي غشاء فراهم كرده و توسط فرايندهاي انتقال همرفت ايجاد شده در اثر فشار تحت تأثير قرار مي گيرد. انتقال مولكولي در بسياري از دستگاههاي ايزولاسيون ايمني توسط فرايندهاي انتشاري كه به وسيله گراديان هاي فشار ايجاد مي شوند كنترل مي گردد. شار انتشاري را مي توان بر اساس قانون فيك نشان داد:

(7)

جايي كه F= شار انتشاري در واحد سطح بخش  = ضريب مؤثر انتشار  = گراديان غلظت ماده حل شده در طول ضخامت غشاء () مي باشند.

معادله (7) را مي توان به صورت ذيل خلاصه كرد.

كه ضخامت غشاء پخشندگي و ضريب تفكيك همگي در ضريب انتقال توده غشاء  با واحد سانتي متر بر ثانيه نهفته است.

معادله (7) بيان مي‌كند كه شار انتشاري با ضخامت غشا نسبت معكوس دارد اما گزينش گري مستقل ضخامت است. اين امر منجر به توسعه غشاهاي فوق نازك كه داراي شرايط تفكيك قابل قبول شار انتشاري فراغشايي هستند شد. (توجه داشته باشيد كه اين حالت براي غشاهاي به كار رفته در كاربردهاي همرفت نيز صدق مي‌كند). غشاهاي نامتقارن متداول بصورت يك سري لايه جداساز با بستر محافظ عمل مي كنند. بستر محافظ حداقل مقاومت انتقالي و حداكثر استحكام مكانيكي را فراهم مي‏كند. تعيين آزمايشگاهي خصوصيات انتشاري دستگاه در هر دو محدوده وزن مولكولي وزن بالا و پايين براي درك محيط كپسوله شده سلولي ضروري است.

انتقال مولكولي در يك دستگاه ايزولاسيون ايمني به وسيله پس زني (رانش) فضايي ايجاد شده توسط خلل و فرج هاي غشاء و تخلخل توده تخت تأثير قرار ميگيرد. خصوصيات انتشاري گونه هاي با وزن مولكولي كوچكتر توسط تخلخل سراسري غشاء كنترل مي شود، در حالي كه خصوصيات انتشاري وزن مولكولي بزرگ تر توسط اندازه خلل و فرج غشا كنترل مي شود. جهت اندازه گيري انتقال توده انتشاري براي شارش بالا، گونه هايي با وزن مولكولي كم (g/mol 1000-180 ) و همچنين شارش كم، گونه هايي با وزن مولكولي بالا (g/mol 150000-60000) براي غشاهاي فيبر توخالي (P(AN-VC روش هايي توسعه يافته اند.

دستگاه آزمايشگاهي اندازه گيري انتشار وزن مولكولي كوچك شامل يك بخش دياليز است كه در آن يك محلول ردياب پيرامون فيبر در خارج گردش مي‌كند در حالي كه محلول نمونه برداري به طرف پائين مجراي فيبر جريان دارد. نرخ هاي شارش طوري تنظيم مي شود كه آرايش لايه مرزي دروني و خارجي فيبر حداقل باشد. ضرائب انتشار از اختلاف غلظت ميان مجرا و حمام در يك نرخ شارش مجراي مشخص محاسبه مي شوند. اين آزمون براي اندازه گيري ضرائب انتشار در ميان اين غشاهاي شارش آب نسبتاً بالاتري براي گلوكز (186 MW) ويتامين (MW1.3kDa)B₁₂ و سايتوركروم (MW13.4kDa).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

براي گونه هاي مولكولي بزرگ، مقاوت هاي غشاء بسيار بزرگ تر از مقاومت اي لايه مرزي است، بنابراين طرح آزمايشگاهي، شار (جريان) را در بر نمي گيرد. اندازه گيري را مي توان با انتشار ردياب در طول غشاء در هر راستا انجام داد. زيرا سنجش در دو راستا نتايج يكساني را براي مقدار ضريب انتشار مي دهد. اين آزمون براي سنجش ميوگلوبين گونه هاي پروتئين BSA و IgG و گونه هاي دكستران از MW50000 تا 300000 توسعه يافته است. براي افزايش حساسيت اندازه گيري، گونه هاي نشان دار فلورسانت به كار برد مي شود. شكل 3-59، نمودار انتشار دكستران در طول غشاء P(AN-VC) را با در نظر گرفتن آب كل به صورت تابعي از وزن مولكولي دكستران نشان مي دهد.

خلاصه (چكيده)

لايه سازي غشاء براي درمان سلول كپسوله شده به منظور ارائه دامنه گسترده اي از محصولات نشأت گرفته از مولكلول هاي كوچك (براي مثال، دپامين، انكفالينز) تا محصولات ژني بسيار بزرگ (براي مثال، فاكتورهاي رشد، گلوبولين هاي ايمني) تحت بررسي است. نكات كليدي در استفاده از مواد جهت ساخت اين دستگاهها عبارتند از: 1- غشاء زيست سازگار، اجزاء دستگاه و مواد ماتريس 2- كاشتني هاي محكم و 3- موادي كه با خصوصيات انتقال مناسب درون غشاء قابل ساخت هستند. اين فصل تلاش مي‌كند كه به روش هاي تأثير گذار يا سنجش استحكام غشاء و خصوصيات انتقال متمركز شود. هر دو اين خصوصيات براي هر سيستم كاشتني تجاري ضروري است. خصوصيات انتقال غشاء براي كليه سيستم ها حياتي است، چه دستگاه كاشتني باشد و چه برون بدني. با استفاده از روش هاي ساخت غشا مي توان غشاهايي با استحكام دو يا چهار برابر استحكام وارونگي فاز در غشاهاي سنتي توليد كرد. با استفاده از تجهيزات جديد اندازه گيري انتقال با وزن مولكولي كوچك و بزرگ مي توان غشاهايي با تركيب ايزولاسيون ايمني دلخواه ساخته و نرخ هاي تحويل محصولات را براي بسياري از كاربردهايي كه بالقوه بر درمان مجموعه گسترده اي از بيماريها تأثير مي گذارد، گزينش كرد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

كيومين وانگ و كوين – اي – هيلي

داربست هاي پليمري بكار رفته به عنوان جانشين براي ماتريس برون سلولي ارثي (ECM)، براي بازسازي استخوان، غضروف، كبد، پوست و بافت‏هاي ديگر استفاده مي‌شود. پلي لاكتيد (PL)، پلي گليكوليد (PG) و كوپليمرهاي آنها (PLG) مواد مناسبي براي اعضاء جانشين به شمار مي روند، زيرا در هنگام كاشت در اثر هيدروليز بطور تصادفي تخريب شده و محصولات تخريبي آنها به شكل دي اكسيد كربن و آب كلاً از بدن خارج مي‌شود.

يك داربست ايده آل بايد داراي تخلخل مناسب براي انتشار مواد غذايي بوده و امكان پاكسازي مواد زائد را داشته و داراي پايداري مكانيكي مناسبي جهت تثبيت و انتقال بار باشد. علاوه بر اين، شيمي سطح ماده بايد چسبندگي سلول و علامت دهي داخل سلولي را به نحوي ارتقاء دهد كه سلول ها فنوتيپ طبيعي خودشان را بروز دهند. براي رشد سريع سلول، داربست بايد همچنين داراي ميكرو ساختار بهينه باشد (براي مثال، اندازه خلل و فرج، شكل، و مساحت ويژه سطح). اثر اندازه خلل و فرج كاشتن بر بازسازي بافت توسط آزمايشاتي كه نشان دهنده اندازه خلل و فرج بهينه براي فيبر وبلاست درون رست بين 20 و  براي بازسازي پوست يك پستاندار بالغ و  بسته به مكانيزم، براي بازسازي استخوان است، مشخص مي‌شود. بدين ترتيب، هدف اصلي در ساخت داربست ها براي بازسازي بافت، كنترل دقيق اندازه خلل و فرج و تخلخل است.

داربست هاي پليمري زيست تخريب پذير ميكرو متخلخل توسط روش هاي متعددي كه شامل قالب گيري حلال(solvent casting)- فرو شستن (پالايش)ذرات(particle leaching)، تفكيك فازيphase separation))، تبخير حلال(solvent evaporation)  و باند كردن فيبر(fiber bonding) براي شكل دهي شبكه پليمر هستند، آماده مي شوند. اين روشها به طور مفصل در فصل هاي ديگر آورده شده است. در اين فصل، قصد داريم يك شيوه پردازش جديد براي ساخت داربست‏هاي PLG بسيار متخلخل با مزاياي اضافي كه قابليت تلفيق رشد پايه پروتئيني و فاكتورهاي تفاضلي در زمان پردازش را دارند معرفي كنيم. اين شيوه خصوصاً ساخت دار بست هايي با تخلخل بيشتر از 90% و توانايي كنترل خلال و فرج هايي به اندازه 20 و  را در بر مي‏گيرد.

اين روش پردازش شامل ايجاد يك امولسيون ازطريق هموژنيزه كردن (همگن سازي) محلول پليمر – حلال و آب، سرد كردن سريع امولسيون جهت حفظ ساختارحالت مايع و حذف حلال و آب در اثر انجماد و خشك سازي است.

-موادMATERIALS                                                                                              پلي دي ال – لاكتيد /گليكوليد (PLG) نرح مولي 15 : 85 ؛ پليمرهاي بيرمينگهام،

بيرمينگام، AL (ايالت آلاباما)

كلريد متيلين (Mc)، تشخيص باكستر(baxter diagnostics)، مك گراپارك، IL (ايالت ايلينوي) آب فوق خالص: درجه  

NaCl , Cacl₂ و آلبومين سرم گاوي (BSA)، سيگما – آلدريچ، سنت لوئيس، MO (ايالت ميسوري) پلي اتيلن گليكول (PEG)، شركت شيميايي فلوكا، رونكونكوما، NY (نيويورك)

-تجهيزاتEQUIPMENT                                                                                     هموژنايزر (همگن ساز)دستي، موسسه بين الملل امني، واتربري (ايالت كنتيكت) تخلخل سنج جيوه ران (MIP)، تخلخل سنج اسكن خودكار 33، موسسه (شركت) كوانتاكروم، سيوست، (نيويورك) NY

وجود يك دستگاه انجماد – خشك ساز اصلاح شده ضروري است زيرا دستگاههاي انجماد – خشك ساز تجاري قابليت انجماد – حشك سازي MC ياحفظ دمش خلاء از بخارات MC را ندارند.

اين سيستم از يك متراكم كننده (چگال ساز) (ويرتيس)  -110c، متصل به يك تله نيتروژن مايع (ويرتيس، گاردينر، نيويورك)، متصل به يك پمپ خلاء مقاوم در برابر مواد شيميايي (BOC , RV12) محصولات خلا (كششي) ادواردز، ويلمينگتون، ايالت ماساچوست) كه قابليت كشش خلاء به درون سيستم را تا حدود motorr 20 دارند، تشكيل شده است.

نمودار فرآيند ساخت در شكل 1-60 نشان داده شده است. در ابتدا دو محلول مخلوط نشدني، فاز آلي و فاز آب را تشكيل مي دهند. فاز آلي توسط حل شدن PLG با ويسكوزيته ذاتي ويژه  در MC چنان انجام مي‌شود تا وزن در درصد حجم كل كل مطلوب امولسيون بدست آيد. فاكتورهاي زيست فعال هيدروفوبيكو عوامل فعال در سطح را نيز مي توان در اين فاز جهت تلفيق و ارائه و كنترل ميكرو ساختار داربست حل كرد. فاز آب، از آب فوق خالص به همراه يا بدون افزودني هاي حل شدني مختلف مانند فاكتورهاي زيست فعال هيدروفيليك براي تلفيق و ارائه ايجاد مي‌شود. براي نمونه نمك هاي CaCl₂ يا NaCl و يا عوامل فعال در سطح جهت كم به كنترل ميكرو ساختار بكاربرده ميشوند. فازهاي آب و آلي در يك لوله آزمايش شيشه اي كه 40% حجم آن آب است، به هم اضافه شده و دو لايه نامخلوط را شكل ميدهند. بر اساس مطالعات اوليه، اين درصد حجم آب پايدارترين وضخيم ترين امولسيون مناسب براي ساخت داربست‏ها را ايجاد مي كند.تركيبات ديگر منجر به ذوب شدگي و يا وارونگي فاز مي شوند (به عبارت ديگر شكل گيري ميكرو كره‏ها). اين لايه‏هاي نامخلوط به وسيله يك همگن ساز دستي كه در سرعت هاي مختلف تنظيم ميشود، همگن شده ودر يك قالب مناسب ريخته مي‌شود (براي مثال، شيشه يا مس). سپس با گذاشتن سريع قالب بر روي بلوك مس كه در كنار نيتروژن مايع با دماي (~ -196c) قرار دارد سرد مي‌شود. سپس نمونه ها در يكدستگاه انجماد –خشك ساز سفارشي motorr20 و دماي آغازين -110C منجمد و خشك مي شوند. بعد از اينكه دماي داخل امولسيون براي يك ساعت در 110c- به تعادل رسيد، دستگاه متراكم ساز خاموش شده و دستگاه متراكمساز و امولسيون به آرامي در طي 12 ساعت تا دماي اطاق گرم مي شوند. نمونه‏هاي بدست آمده در يك دستگاه خشك ساز خلاء در دماي اتاق براي ذخيره سازي وحذف بيشتر هر گونه حلال باقيماند قرارداده مي شوند. جهت كمينه سازي اتلاف پروتئين در طول فرايندساخت، يك شبكه نفوذي پلي اكريلاميد –كوپليمرشده با – اتيلن گليكول، با يك همگن ساز وماده شيشه اي پيوند زده مي‌شود تا رونشيني پروتئينadsorption)) از بين برود.

 

 

 

 

 

 

 

- تشريح (توصيف) داربست هاCHARACTERIZATION OF SCAFFOLDS         ميكرو ساختار داربست ها را مي توان از نظر كيفي بوسيله ميكروسكوپي اسكن الكترون ولتاژپايين (SEM)(1.3KV) و از نظر كمي توسط روش تخلخل سنجي جيوه ران (MIP) براي تعيين متوسط خلل و فرج و تخلخل كه در جاهاي ديگر نيز گفته شده است، تحليل كرد. بطور كلي، كليه داربست هاي امولسيوني ساخته شده توسط روش انجماد – خشك سازي در محدوده درصد وزني PLG كه بطور خلاصه بيان شد و 40% حجمي آب، داراي تخلخلي بيشتر از 90% بوده و داراي مناطق سطح ويژه اي در حدود  هستند. اين داربست ها داراي خلل و فرج هاي بسيار تو در تو با توزيع اندازه خلل و فرج بزرگ مي باشند. بزرگ ترين خلل و فرج ها، بيشتر از  هستند. البته، متوسط اندازه هاي خلل و فرج خاص با تغيير شرايط پردازش مشخص است.

داربست ها از طرفي كه امولسيون بعد از متخلخل شدن در قالب، در معرض محيط قرار مي گيرد، داراي پوسته غير متخلخل هستند. داربست هاي ضخيم، همگن،از نظر فيزيكي قابل كنترل، بدون حفره هاي فراوان (mm1> خلل و فرج‏هاي) به عنوان داربست هاي خوب شناخته مي شوند

به غير از درصد حجم درحجم آب، اثرات كليد متغيرهاي ديگر نيزبركيفيت فيزيكي وميكرو ساختار داربست بررسي شدند. بدليل اينكه اين فرآيند، متغيرهاي فراواني را در بر مي گيرد، ارزيابي اثرات آنها با بكارگيري يك طرح آزمايشگاهي كه تمامي فاكتورها را درنظر گيرد به تعداد آزمايشات تقريبا بي شماري نيازخواهد داشت.

براي مثال، در يك فرآيند 4 متغيره، هر كدام با 3 حالت ممكن، حداقل تعداد آزمايشات براي ارزيابي متغيرهاي تاثير گذار بر ميكرو ساختار داربست برابر 81=3⁴  خواهد بود. براي كمينه كردن تعداد آزمايشاتي كه به آرايه هاي عمودي طراحي شده آماري نياز دارند، و براي تعيين مهم ترين متغيرهاي كنترل، تحليل آزمايشگاهي تاگوچي مورد استفاده قرار مي گيرد. متغيرهاي مورد بررسي شامل، غلظت PLG وزن مولكولي PLG، سرعت همگن سازي، تثبيت كننده‏هاي امولسيون اضافي وعوامل فعال در سطح مي شوند. جدول 1-60 حاوي چكيده اي از اثرات اين متغيرها بر ميكروساختار و كيفيت فيزيكي داربست است.

 

 

 

 

 

-غلظت PLGPLG CONCENTRATION                                                        تاثير سهم وزني پليمر (5 و w/v 10 پليمر) بر ميكروساختاروكيفيت فيزيكي داربست ارزيابي شده است. غلظت هاي پليمر بيشتر از w/v 10% براي ساخت داربست مناسب نيستند، زيرا ويسكوزيته بالاي فاز آلي از همگن سازي مناسب جلوگيري ميكند. نمونه هايي با w/v 5% PLG، ذوب شدگي قابل ملاحظه اي را از خود نشان دادند كه به ميكروساختار آسيب وارد مي كند، در حاليكه نمونه هاي با w/v 10% PLG داراي كيفيت فيزيكي بهتري بودند. لذا w/v5% PLG به عنوان متغير پردازشي زيست پذير در نظرگرفته نمي شود. ما همچنين مقدار مياني  را با موفقيت آزمايش كرديم.

- وزن مولكولي PLG PLG MOLECULAR WEIGHT                                       اثر  ‍PLG، 57/0 و  ارزيابي شد. افزايش  ‍PLG سبب بالا رفتن اندازه متوسط خلل و فرج و خصيصه هاي فيزيكي مي‌شود. اندازه متوسط خلل وفرج مستقيماً توسط ويسكوزيته محلول پليمر تاثير مي پذيرد.بنابراين نمونه هاي با  بالاتر، ويسكوزتر (لزج تر) هستند. اين مشاهدات مي تواند بدليل دو فاكتور ذيل باشد : بر طبق قانون استوك، افزايش  نرخ خامه اي شدن را بوسيله افزايش چگالي محلول پليمر وويسكوزيته امولسيون كاهش مي دهد. و بر طبق عبارت استوك – انيشتين براي ضريب انتشار، افزايش ويسكوزيته محلول پليمر،نرخ كركينه سازي(flocculation rate) را كاهش مي دهد.

داربست هاي ساخته شده با سرعت هاي همگن سازي 5000 و rpm 17500 نشان مي دهند كه سرعت همگن سازي بالاتر منجر به بزرگ شدن اندازه متوسط خلل وفرج شده و خصوصيات فيزيكي را بهبود مي بخشد. اين وضعيت دور از ذهن است زيرا تئوري بيان مي كند كه افزايش نرخ برش سبب كاهش اندازه كروي فاز آب و در نتيجه اندازه خلل و فرج مي‌شود. البته افزايش نرخ برش حبابهاي هوا را در امولسيون القا كرده و بدين ترتيب سبب ايجاد داربست هايي با اندازه خلل و فرج هاي بزرگ مي‌شود. با وجود افزايش اندازه خلل و فرج، اين روش پردازش متغير بوده و كنترل آن دشوار است.در نرخ هاي برشي پايين تر، وجود حباب هاي هوا يك فاكتوربه حساب نمي آيد.

اثرات تثبيت كننده ها و عوامل فعال در سطح امولسيون و غلظت آنها برميكرو معماري و كيفيت فيزيكي داربست بررسي شده اند. تثبيت كننده هاي امولسيون و غلظت هاي تست شده آنها عبارت بودند از:  اين. الكتروليت ها قبل از مرحله همگن سازي به فاز آب اضافه شدند. بر اساس تئوري درجا گوئين لانداو – فروي – اوربك (DLVO) متوجه مي شويم كه وجود غلظت الكتروليت هايي مانند CaCl₂ و NaCl مي تواند پايداري امولسيون هاي روغن درآب را با تاثير گذاري بر طول دبي بخاطر نيروي پس زني الكتريكي بين ذرات تغيير دهد.با وجود اينكه تئوريDLVO ناشي از ذرات كلوئيدي دريك محيط قطبي (به عبارت ديگر، امولسيون روغن درآب) است و امولسيون بكار رفته در اينجا بر عكس است، اما اين تئوري به همراه مفهوم افزايش نيروهاي پس زني و الكتريكي با حدود طولاني جهت افزايش پايداري امولسيون در اين كار بكار گرفته مي‌شود. غلظت هاي مختلف الكتروليت براي فشرده سازي ذرات براي افزايش تخلخل نهايي و اجازه ندادن به ادغام شدن (يكپارچه شدن)همزمان ( به عبارت ديگر شكست امولسيون) انتخاب شده اند.

افزايش غلظت NaCl يا CaCl₂ به پايداري سازي (تثبيت) امولسيون كمك كرده واجازه آرايش داربست هاي ضخيم با متوسط اندازه خلل و فرج كوچك تر را مي دهد. از آنجا كه الكتروليت ها در فاز (ناپيوسته) آب هستند، NaCl يا CaCl₂ ذرات سطح آب را باردار كرده و سبب افزايش نيروهاي پس زني الكترواستاتيك با حدود طولاني (بلند) در ميان حلال MC غير قطبي مي شوند. بدين ترتيب، بالا رفتن غلظت الكتروليت ظاهراً سبب افزايش نيروهاي پس زني الكترواستاتيك شده و با جلوگيري از تجمع و ادغام نهايي، طول دبي را نيز كه به تثبيت ذرات كوچكتر در امولسيون كمك مي كند، افزايش ميدهد.

درمطالعات انجام شده بر روي دو عامل فعال در سطح BSA , PEG قبل از مرحله همگن سازي به فاز آب افزوده مي شوند BSA , PEG به امولسيون اضافه مي شوند تا به عنوان عامل فعال در سطح و تثبيت كننده فضايي عمل كرده تا از ادغام (يكپارچگي) ذرات متفرق شده جلوگيري كند.توجه داشته باشيد كه، عوامل فعال در سطح ديگر مانند پلوروئيك‏ها، اسپان و تويين نيز مي توانند مورد استفاده قرار گرفته و متناسب باعامل فعال در سطح مي توانند به فاز آب يا آلي اضافه شوند. غلظت PEG در w/v 0.1% تثبيت مي‌شود زيرا وارونگي فاز در غلظت هاي ديگر رخ مي دهد و در عوض اثر وزن مولكولي، متوسط وزني PEG ( Da 35000 يا 20000 M_w) بررسي شد. غلظت PEG طوري انتخاب شد تا در محدوده غلظت بحراني ريز واره(micelle) (cmc) باشد كه در حدود M است . cmc به عنوان غلظتي كه در آن آرايش ريز واره بحراني مي‌شود تعريف گرديده و آن غلظتي است كه در آن اثر عامل فعال در سطح قابل ملاحظه مي‌شود.وزن هاي مولكولي متفاوت نيز مي توانند مورد استفاده قرار گيرد. البته بايد توجه داشت كه وزن ملكولي متوسط وزني M_w بر cmc تاثير مي گذارد

 

 

 

 

 

 

افزايش PEG M_w, سبب كاهش اندازه خلل و فرج مي‌شود. گرچه اين عامل كم اهميت ترين متغير درمقايسه با فاكتورهاي ديگر به حساب مي آيد، اما دركنترل كردن اندازه متوسط خلل و فرج اثر قابل ملاحظه اي دارد. توجه كنيد كه هر چقدر M_w كوچكتر باشد تعداد مولكولهاي PEG تا زماني كه  مشابه به كار برده شود، بزرگتر مي‏شود. اين افزايش M_w، cmc را كاهش داده و به همراه غلظت PEG بالاتر، cmc با سرعت بيشتري بدست آمده و خارج مي‌شود.

بدين ترتيب براي افزايش پايداري امولسيون، cmc پايين تر از ارجحيت دارد، زيرا شكل گيري ريز واره‏ها بسيار سريعتر شده و ذرات كوچكتر اجازه شكل گيري دارند.

براي BSA، اثر غلظت (امولسيون 02/0 ، 01/0 ،2/0 ،5/0 ، 1 يا 2) ارزيابي شد، همچنين داربست هاي بار شده با 01/0 امولسيون و بدون هيچ گونه CaCl₂ يا PEG ساخته شدند تا افزايش اثرات آنها بررسي شود. غلظت BSA تا زماني كه از  2/0 امولسيون تجاوز نكند، بر اندازه متوسط خلل و فرج تاثير قابل ملاحظه اي ندارد (شكل 2-60). در غلظت هاي كمتر از 2/0 امولسيون، متوسط اندازه هاي خلل و فرج بين 55 و 70 بود. غلظت هاي بين 2/0 و 1 امولسيون، BSA به عنوان يك عامل فعال در سطح و محافظت كلوئيد عمل كرده تا اندازه ذرات متفرق فاز (آب) را كاهش دهد (به عبارت ديگر، متوسط اندازه خلل و فرج)؛ بدين ترتيب هر چقدر غلظت بالاتر باشد، متوسط اندازه خلل و فرج كوچك تر خواهد بود. به نظر مي رسد كه در غلظت هاي بيشتر از 1 امولسيون، اثر عامل فعال در سطح به حد عملي رسيده باشد زيرا متوسط اندازه خلل و فرج در حدود 8/05/6 بدست آمد. همه داربست ها داراي تخلخل و مساحت سطح ويژه بسيار بالا هستند ( به ترتيب 90% > و ) كنترل اندازه متوسط خلل و فرج از طريق تنظيم غلظت پروتئين به توانايي پروتئين‏ها در تاثير گذاري بر تثبيت امولسيون‏ها بستگي دارد. پروتئين ها در حد فاصل امولسيون ها رونشين و جمع شده و به عنوان عوامل فعال در سطح و محافظ كلوئيد عمل مي كنند. واسطه امولسيون بكار رفته در اين آزمايش شامل فاز هيدرو فوبيك (MC/PLG) است، آب زدايي لايه هاي هيدرو فوبيك از انرژي آزاد گيبز بين سطحي مطلوب پروتئين پيراگير سطح هيدرو فوبيك مي كاهيد.

آلبومين با قابليت تطبيق ساختاري بالا در تغيير شرايط محيطي، حتي اگر آب زدايي و يا بر هم كنش هاي ديگر نامطلوب باشند، تمايل به رونشيني در اغلب سطوح را دارد. اين كارآيي بيشتر توسط بار خالص منفي فراوان آلبومين ايجاد مي‌شود كه پايداري ساختار مولكول در در محلول كاهش داده و احتمال رونشيني آني (خودجوش) را افزايش مي دهد. اين رونشيني ترجيحي پروتئين (BSA) در حد فاصل، بر پايداري امولسيون و در نتيجه اندازه متوسط خلل و فرج داربست اثر مي گذارد. البته، با حذف CaCl₂ و PEG، اثر عامل فعال در سطح BSA (01/0 امولسيون) تشديد شده و سبب كاهش شديد اندازه متوسط خلل و فرج از  به  مي گردد (شكل 3-60). تحليل MIP توزيع اندازه خلل و فرج در شكل 4-60 نشان داده شده است. همچنين، توزيع بزرگ اندازه خلل و فرج نيز با تمايز كامل در متوسط خلل و فرج بين گروههاي 1 و 2 نماش داده شده است. بدين ترتيب، اثرات CaCl₂ و PEG به اثرات BSA اضافه نمي شود.

 

 

 

 

 

 

-روش ارحج ساخت داربست

بر اساس اطلاعات ذكر شده كه در جدول 1-60 خلاصه شده است، مجموعه ارجح شرايط ساخت داربست با كنترل اندازه خلل و فرج و كيفيت خوب فيزيكي به شرح زير مي باشد؛ غلظت PLG،

سرعت همگن سازي  . داربست هاي ساخته شده بر اساس اين پارامترها داراي كيفيت خوب فيزيكي و اندازه متوسط خلل و فرج  هستند. داربست هايي با كمترين اندازه متوسط خلل و فرج را مي توان با افزودن غلظت هاي بالاي BSA (  در  2 امولسيون) يا NaCl ( در M1) بدست آورد. شرايط پردازش و اندازه متوسط خلل و فرج در جدول 2-60 خلاصه شده است.

PROCESSING OF POLYMER SCAFFOLDS : POLYMER – CERAMIC COMPOSITE FORMS

كاتو- تي – لاورن سين، هلن، اچ – لو، و يوسف خان

پليمرها و سراميك ها به طور جداگانه يا تركيبي به شكل مكمل يا گزينه اي براي نسج آلوگرفت و زنوگوفت به عنوان جايگزين بافت سخت در كاربردهاي دنداني و ارتوپدي بكار برده مي شوند، و از آنجا كه هر ماده خصوصيات ذاتي خود را دارد، براي كاربردهاي خاصي مناسب خواهد بود. چندين پليمر زيست تخريب پذير در پروژه‏هاي تحقيقاتي و استفاده‏هاي باليني براي كاربردهاي ماهيچه اي – اسكلتي مورد آزمايش قرار گرفته اند. پلي ارتو استرها، پلي انيدريدها، پلي فسفازن ها و پلي آمينواسيدها همگي به عنوان جايگزين هاي استخواني به واسطه تخريب پذيري منحصر به فرد و خصوصيات مكانيكي شان امتحان شده اند.

پليمرهاي تخريب پذير خانواده پلي -  هيدروكسي اسيد شامل پلي لاكتيك اسيد (PLA)، پلي گليكوليك اسيد (PGA) و كوپليمر آن پلي لاكتيك – كو-گليكوليك اسيد (PLAGA) به طور گسترده به عنوان صفحات تثبيت، پيچ ها و پين ها و همچنين دستگاههاي رهايش دارو و داربست‏هاي مهندسي بافت مورد استفاده قرار مي‏گيرند. سراميك هاي مختلفي وجود دارند كه به تنهايي يا به همراه پليمر ها براي كاربردهاي ارتوپدي ازجمله تري كلسيم فسفات، تتراكلسيم فسفات، هيدرو كسي آپاتيت و كامپوزيت هاي پايه مواد زيست فعال، بكار برده مي شوند. اين سراميك ها با پليمرهاي تخريب پذير و تخريب ناپذير مختلفي تركيب مي شوند تا سبب اصلاح استحكام پليمرها، چسبندگي به استخوان، تخلخل، و قابليت تحريك درون رشد استخوان گردند. يك ار مطلوب ترين اين تركيبات، تركيب PLAGA و هيدروكسي آپاتيت به شكل يك كامپوزيت چند كاره قابل استفاده در مهندسي بافت است با توجه به اين موضوع، سه روش مختلف براي ايجاد داربست كامپوزيت PLAGA و هيدروكسي آپاتيت بيان مي‌شود: فيلم پليمر – سراميك توليد شده توسط روش قالب گيري حلال، ساختارهاي پليمر- سراميك سنتز شده توسط روش تجمع حلال و ساختارهاي پليمر- سراميك سنتز شده با استفاده از روش ژل – ريز (ريزدانه).

مهندسي بافت را مي توان به شكل كاربرد بيولوژيكي، شيميايي و اصول مهندسي در جهت ترميم، مرمت يا بازسازي بافت هاي زنده با استفاده از بيومواد، سلولها و فاكتورها به تنهايي و يا بصورت تركيبي مورد استفاده قرارداد. هم سراميك ها و هم پليمرها داراي خصوصيات ذاتي كاملاً مجزايي بوده و هر يك از آنها بطور گسترده در شكل بيو مواد در بازسازي بافت هاي زنده بكار گرفته مي شوند، كه اين كاربردها به خوبي در مدارك موجود ارائه شده است. براي مثال ، سراميك ها در ترميم بافت سخت از جمله كاربردهاي ماهيچه اي – اسكلتي و دندان استفاده مي شوند. پليمرها نيز بطور گسترده در كل بدن به شكل جايگزين هاي موقت و دائم براي شريان ها استخوان‏ها، و مفاصل و بازسازي پلاستيكي و غيره بكار مي روند.

معمولاً يك نوع ماده به تنهايي نمي تواند هم ويژگي هاي مطلوب مكانيكي و هم شيميايي را براي يك كاربرد خاص برآورده سازد. در اين نمونه ها مواد كامپوزيت كه تركيبي از مزاياي هر دو ماده هستند بسيار مناسب تر خواهند بود. مطلوب ترين حالت در اينجا تركيب پليمرها و سراميك ها به شكل يك كامپوزيت چند كاره قابل استفاده در مهندسي بافت است. گزينه مصنوعي پليمر – سراميك به طور ويژه براي پيوندهاي بيولوژيكي مانند بافت هاي پيوندي خود شخص يا نسج پيوندي بيگانه طراحي مي شوند. اين فصل به طور اجمالي كاربرد اين دو نوع ماده را به تنهايي يا به صورت تركيبي براي بازسازي بافت ماهيچه اي اسكلتي و دنداني شرح مي دهد.

- پيوندهاي متداول استخوانCONVENTIONAL BONE GRAFTS               - پيوند نسخ خود شخصAUTOGRAFTS                                                         برترين استاندارد رايج در حال حاضر در پيوندهاي استخوان، پيوند نسج خود شخص است كه در آن بافت از استخوان تاج ايلياك بيمار جدا شده و به قسمت آسيب ديده منتقل مي‌شود. از نظر ساختاري پيوند نسوج خود شخص هم داراي قابليت هدايت استخواني (osteoconductive) و هم داراي قابليت القاي استخواني (osteoinductive) است كه منجر به فراهم شدن قالبي مي‌شود كه در آن بافت و عروق استخوان جديد در زمان تحريك بازسازي استخوان بوسيله جدا سازي سلولهاي مزانشيمال در استئوبلاست هاي شكل دهنده استخوان توانايي رشد پيدا مي كنند. البته، تعداد بافت هاي پيوندي از خود شخص محدود بوده و اغلب اوقات محل اهدا كننده دچار بيماري مي‌شود. علاوه بر اين، عمل جراحي لازم براي خارج سازي بافت سبب ايجاد دردها و عوارض بعدي مي گردد.

- پيوند نسج بيگانهALLOGRAFTS                                                                     اصول باليني پيوند نسج بيگانه همانند پيوند نسج خود شخص است. در اين مورد، بافت اهدا شده از شخص دوم يا جسد بدست مي آيد. اين وضعيت مشكل بيماري محل اهدا كننده را رفع كرده اما محدوديت هايي را نيز به دنبال دارد. البته، خطر انتقال بيماري و پس زني كاشتن افزايش مي يابد. با وجود اين، اين نوع پيوند يك ساختا رهدايت استخواني را براي درون رويش استخوان فراهم كرده و فرايند ضروري استريليزاسيون (سترون كردن) بافت در آن سبب كاهش پتانسيل القايي استخوان مي‌شود كه اغلب منجر به تشكيل ساختاري با ويژگي مكانيكي تقريباً مناسب مي گردد.

در حال حاضر جايگزين هاي بافت استخوان داراي بازار قابل توجهي هستند. تنها در ايالات متحده، در حدود 2/6 ميليون شكستگي در سال رخ مي دهد كه در حدود 500000مورد آن به گونه اي از پيوند استخوان نياز دارد. علاوه بر اين، هزينه ميانگين روند پيوند استخوان بالغ بر 5000 $ شده و هزينه كل دوره درمان در سال معادل 5/2$ بيليون مي‌شود.با وجود محدوديت هاي مربوط به پيوندهاي بيولوژيكي، مهندسان و بالين شناسان در جهت توسعه جايگزينه هايي براي پيوند استخوان با هم همكاري مي كنند.

-استدلالهايي براي بيومواد كامپوزيت

استخوان بيولوژيكي از دوفاز آلي و غير آلي تشكيل شده است. در حدود 70% فاز غير آلي را فسفات كلسيم كه اغلب به شكل مواد معدني نيمه بلورين به نام هيدروكسي آپاتيت تشكيل مي دهد كه مسئوليت استحكام مكانيكي استخوان را بر عهده دارد. انواع مختلفي از سراميك ها زيست سازگار تشخيص داده شده و به رشد استخوان و پايداري كاشتني كمك مي كنند. براي مثال هايي از اين نوع مي توان، كورالين، سولفات كلسيم، فسفات كلسيم، شيشه زيست فعال 45S5 بكار برده شده و مي توان آنها را توسط آميختن خشك يا قالب گيري فشاري با پليمرها تركيب كرده و يا توسط تعديل شيميايي (chemical modifications) بر سطح پليمر شكل داد. (جدول 1-61). البته مواد سراميكي اغلب تخريب پذير نبوده و به واسطه طبيعت شكننده و ويژگي كششي ضعيف از نظر مكانيكي با استخوان طبيعي زيست سازگار نيستند.

درحال حاضر دسته هاي مختلفي از پليمرها به عنوان كانديد ترميم استخوان در نظر گرفته مي شوند. پلي متيل متاكريلات (PMMA) از اوايل 1960 به عنوان سيمان استخواني مورد استفاده قرار گرفت و امروزه نيز بطور گسترده به تنهايي و يا گاهاً به صورت تركيب با موادي مانند فيبرهاي تيتانيم و سراميك ها بكار برده مي شوند. پلي اتيلن پرتو زده گاما به دليل داشتن مقاومت خستگي بالا و زيست سازگار بودن به طور گسترده در كاشتني هاي جايگزين مفصل بكار گرفته مي‌شود. در حال حاضر پليمرهاي تخريب پذير فراواني در پروژه هاي تحقيقاتي و استفاده هاي باليني براي كاربردهاي ماهيچه اي – اسكلتي تحت بررسي هستند. پلي ارتو استرها، پلي انيدريدها پلي فسفازن ها و پلي آمينو اسيدها بخاطر تخريب پذيري منحصر به فرد و ويژگي هاي مكانيكي همگي به عنوان جايگزين هاي استخوان آزموده شده اند. خانواده پلي  - هيدروكسي اسيد، پليمرهاي تخريب پذير شامل پلي لاكتيك اسيد (PLA)، پلي گليكوليك اسيد و كوپليمر آن پلي لاكتيك – كو – گليكوليك اسيد به طورگسترده به عنوان صفحات تثبيت كننده، پيچ‏ها و پين ها، همچنين دستگاههاي رهايش دارو و داربست هاي مهندسي بافت مورد استفاده قرار مي گيرند. PLAGA , PGA , PLA داراي مزاياي اضافي هستند كه توسط سازمان غذا و دارو آمريكا (FDA) تاييد شده و به سادگي به شكل ساختارهاي متخلخل با خصوصيات مكانيكي نزديك به استخوان‏هاي ميله اي(trabecular bones) در مي آيند.

براي بهره گيري از مزاياي فوق و كمينه سازي كمبودها، مواد سراميكي با انواع پليمرهاي تخريب پذير و تخريب ناپذير تركيب شده تا به شكل بيو موادهاي كامپوزيت براي ترميم استخوان درآيند. در اينجا بسياري از تحقيقات فعلي و محصولات تجاري موجود تحت بازنگري قرار مي گيرند.

-كامپوزيت هاي پايه كلسيم فسفات (فسفات كلسيم)

CALCIUM PHOSPHATE BASED COMPOSITES                                        فسفات كلسيم اول بار در اوائل 1970 به عنوان پركننده ضايعات استخواني صورت و موارد دنداني بكار برده شد. از آن زمان به بعد، اين ماده به اشكال مختلف براي كاربردهاي ارتوپدي پردازش شد. فسفات هاي كلسيم مانند فسفات تتراكلسيم وهيدروكسي آپاتيت داري زيست سازگاري، بلورينگي وتخريب پذيري متفاوت هستند. فسفات تري كلسيم (TCP) در پيوند با ديگر سراميك ها و سيمان هاي استخواني و همچنين پليمرهاي مختلف نيز براي اصلاح خصوصيات مكانيكي و هدايت استخواني بكار گرفته مي شوند.اكنون TCP به عنوان جايگزين استخوان و وسيله رهايش براي باز تركيب مورفوژنيك پروتئين 2 استخوان انسان (BMP-2) بكار برده مي‌شود. رشد استخوان در تركيب TCP با BMP-2 نسبت به TCP تنها، بيشتر است. كيكوچي و همكارانش، با تركيب TCP و كو-پلي ال – لاكتيد (CPLA) به يك كامپوزيت پليمر – سراميك دست يافتند كه داراي پتانسيل هدايت استخواني و استحكام مكانيكي TCP و تخريب پذيري CPLA بود.

مدول يانگ اين كامپوزيت بدون هيچ گونه اتلاف استحكام خمشي در هنگام اضافه نمودن TCP به CPLA دو برابر CPLA تنها بود. زيست پذيري اين كامپوزيت ارزيابي و تعيين شد تا مشابه كنترل فضاهاي خالي سلولي ها به تنهايي باشد.

همچنين فسفات كلسيم را مي توان با سيمان استخوان تركيب كرده تا كامپويت هاي قابل جذب، خصوصيات مكانيكي مناسب بدست آورد. بروتو و همكارانش پودر TCP را به پلي متيل متا كريلات (PMMA) سيمان استخوان اضافه نمودند تا سيمان استخواني قابل جذب با خصوصيات مكانيكي و پيوندي اصلاح شده جهت كمك نمودن به رشد بهينه استخوان شكل گيرد. اضافه نمودن TCP به PMMA تخلخل سيمان استخوان را افزايش داده اما استحكام فشاري را تا نقطه اي مشابه آنچه براي ديگر كاشتني هاي متخلخل سراميكي رخ مي دهد كاهش مي دهد.

هيدوركسي آپاتيت به طور گسترده به صورت تنها و يا تركيب با پليمرها براي شكل دهي اشكال كامپوزيت جايگزين استخواني بكار برده مي‌شود. مرجان دريايي كه از جنس كربنات كلسيم است، به دليل يكپارچگي دروني و طبيعت زيست واره آن به عنوان جانشين بافت استخوان استفاده مي‌شود.

اين ماده كه در ابتدا براي تبديل كربنات كلسيم به هيدروكسي آپاتيت پردازش مي‌شود. به شكل تجاري توسط شركت بين المللي اينتروپوركرانس تحت عنوان پرواستئون 500 و R500 عرضه مي گردد. البته خصوصيات مكانيكي يك مرجان سالم براي حفظ بارهاي بيولوژيكي معمولي كه توسط استخوان غشائي تحمل مي شود، كافي نيست.

بطور كلي، هيدروكسي آپاتيت (HA) به شكل ذره اي مورد استفاده قرار مي گيرد و اندازه اين ذرات متناسب با كاربرد سفارش داده مي‌شود. تركيب ذرات HA با قطر  با سيمان استخوان PMMA براي افزايش درون رشد استخوان و چسبندگي به دستگاههاي پروتز تثبيت شده توسط سيمان بكار مي رود. موريتا و همكارانش متوجه شدند كه عليرغم پيوند ضعيف بين ذرات HA و سيمان، اضافه نمودن HA، استحكام كششي، فشاري يا خمشي سيمان را كاهش نمي دهد. البته آزمون سيمان استخوان با ذرات HA نشان دهنده افزايش استحكام باند كششي در مقايسه با سيمان بدون ذرات HA بود كه بر پيوند مستقيم HA با استخوان اشاره دارد. مطالعات انجام شده توسط والو و همكارانش اثر مقدار ذرات اضافه شده HA به سيمان استخوان پايه PMMA را بر چگالي سيمان، اندازه خلل و فرج و خصوصيات مكانيكي مورد آزمايش قرار داد. نتيجه اين آزمون ها حاكي از كاهش چگالي سيمان استخوان با افزايش تخلل ناشي از افزايش ميزان HA و كاهش بي اندازه تنش ايجاد شده در اثر افزايش اوليه HA بود. كاهش شديد تنش ايجاد شده در اثر افزايش ميزان HA ناشي از پيوند ضعيف بين HA و سيمان استخوان بود كه منجر به ايجاد حفره هاي بزرگ تر درون استخوان و نواحي بسيار بزرگ با پيوندهاي نامناسب بين سيمان و HA مي گردد. البته، مقادير كم HA اضافه شده به سيمان استخوان هم سبب افزايش تنش ايجاد شده و هم چغرنگي شكست مي‏شود.

آزمايشگاه ما بطور گسترده، امكان بكارگيري داربست پليمر – كامپوزيت براي بازسازي و ترميم بافت استخوان را مورد بررسي قرار داده است. داربست هاي متخلخل حاوي پلي لاكتيد – كو – گليكوليد و بلورهاي HA، توسط استئوبلاست هاي بدست آ‎مده از جمجمه موش شكل گرفته و كاشته مي شوند. پس از طي 24 ساعت، ديده مي‌شود كه استئوبلاست ها به سطح خارجي داربست چسبيده و حتي به درون ساختار متخلخل نفوذ كرده اند. تاثير مقادير HA بر خصوصيات مكانيكي و تخريبي در يك بررسي مجزا، مورد بررسي قرار گرفت. اضافه نمودن HA به داربست، مدول فشاري را تا حدود 400% افزايش مي دهد،در حاليكه ميزان اتلاف توده را كاهش داده و در نتيجه تخريب داربست در طول 6 هفته رخ مي دهد. در نهايت توانايي داربست PLAGA-HA در كمك به تكثير و تفكيك استئوبلاست و همچنين شكل گيري معدني در طول 21 روز مورد آزمايش قرار گرفت.

از اين آزمايش مشاهده شد كه سلولها تا 21 روز تكثير شده و يك لايه معدني بر روي داربست PLAGA-HA تشكيل مي دهند كه نشان گر تفكيك سلولي است. داربست بكار رفته در اين بررسي ها شامل تركيبي از تخريب پذيري PLAGA با حمايت مكانيكي HA بود كه به عنوان جايگزين مهندسي بافت براي ضايعات استخواني است.

BIOACTIVE MATERIAL BASED COMPOSITES                                       مواد زيست فعال، مواد زيست سازگار با توانايي اضافي هستند كه داراي قابليت بهسازي شكل گيري استخواني و باند شدن با بافت استخوان پيرامون هستند شيشه هاي زيست فعال به شكل شيشه هاي ذره اي زيست فعال 45S5 بطور گسترده به عنوان بيومواد بالقوه دركاربردهاي مهندسي بافت ماهيچه اي اسكلتي بكار گرفته مي شوند. توانايي شيشه زيست فعال 45S5 در پيوند با استخوان، اول بار توسط هنچ و همكارانش در اوايل سال 1970 گزارش شد. به واسطه واكنش هاي واسطه اي و ميان سلولي، شيشه زيست فعال سبب رفع كمبود كلسيم و ايجاد لايه فسفات كربنات كلسيم شده كه سبب پيوند شيميايي با استخوان پيرامون مي‌شود.

توانايي يك كاشتني در تشكيل واسطه شيميايي با بافت پيرامون در حذف شل شدگي كه يكي از دلايل اصلي شكست كاشتني مصنوعي است بسيار مهم است. در شيشه زيست فعال مشاهده شد كه علاوه بر قابليت پيوند با استخوان به چسبندگي، رشد و تفكيك استئوبلاست نيز كمك مي كند.علاوه بر اين، مواد زيست فعال سبب القايي – تفكيك سلولهاي مزانشيمال درون استئوبلاست مي شوند.

عليرغم طبيعت يكپارچگي استخواني، هدايت استخواني و القاي استخواني، شيشه هاي زيست فعال به واسطه ناهمخواني مكانيكي با استخوان پيرامون به تنهايي داراي كاربردهاي محدودي درشرايط تحمل بارمي باشند. البته، اين مواد را مي توان جهت تشكيل مواد كامپوزيت داراي پتانسيل ترميم استخوان، با پليمرها تركيب كرد. فوجيتا و همكارانش با اضافه كردن و لفزوتونيت شيشه – سراميك PMMA فرمول يك سيمان استخوان زيست فعال را بدست آؤرند. اين سيمان استخوان زيست فعال در مقايسه با PMMA تنها، استحكام پيوندي بيشتري بين سيمان استخوان و استخوان ران سگ ايجاد كرده و جذب استخواني آن نسبت به PMMA تنها، بيشتر است. ماركونگو و همكارانش با تركيب پلي سولفون با فيبرهاي شيشه زيست فعال، ميله هاي كامپوزيتي ايجاد كرده و آنها را در استخوان ران خرگوش قرار دادند تا آرايش باند مكانيكي بين بافت استخوان و كاشتني كامپوزيتي را مورد بررسي قرار دهند. پس از 6 هفته، استحكام بين سطحي مورد آزمايش قرارگرفته و ديده شد كه ميزان آن بيشتر از دو برابر پلي سولفون تنها است.

كامپوزيت هاي پليمر – سراميك را مي توان با القاي ته تشين مستقيم يك لايه فسفات كلسيم زيست فعال بر سطوح پليمر نيز ساخت. در اين روش، پليمر در يك سيال شبيه سازي شده بدن (SBF) با غلظت يوني شبيه سيال ميان بافتي (interstitial) غوطه ور مي‌شود. پس از نگهداري ماده در SBF يك لايه آپاتيت به آرامي بر روي سطح شكل مي‏گيرد. لايه‏هاي فسفات كلسيم با موفقيت بر روي فيبرهاي تيتانيم، پليمرهاي آلي، كامپوزيت سراميك – پليمر، اتيلن – وينيل الكل و پلي لاكتيد – كو – گليكوليد – تشكيل شدند. مورفي و همكارانش، از تشكيل شدن لايه اپتيت بر سطوح داربست هاي متخلخل سه بعدي گزارش داده و بعد از سپري شدن 16 روز نگهداري، شاهد افزايش مدول فشاري بر روي پليمر تنها، از kpa 50 تا kpa 300 بودند.

آزمايشگاه ما همچنين كامپوزيت هاي شيشه زيست فعال و پليمرهاي زيست تخريب پذير را توسعه داده است كه اين مواد لايه هاي فسفات كلسيمرا در محيط آزمايشگاه تشكيل مي دهند. از آنجا كه شيشه زيست فعال داراي استحكام فشاري بالايي است مي تواند به عنوان يك تقويت كننده مكانيكي براي موادي با استحكام مكانيكي كمتر عمل كند. همچنين توانستيم فيلم هاي كامپوزيت (قالب گيري حلال) شيشه زيست فعال و كوپليمر 50: 50 پلي لاكتيد – كو – گليكوليد، با ساختارمتخلخل، سه بعدي، ريز كروي را بسازيم. اين كامپوزيت ها در هنگام كاشت در محيط آزمايشگاه قادر به ايجاد لايه‏هاي فسفات كلسيم بر روي سطوح بوده و به رشد سريع و فراوان سلولهاي استئوبلاست و شبه استئوبلاست انسان كمك مي كنند (شكل 1-61). علاوه بر اين، اين سلول ها يك ماتريس معدني را بر روي مواد كامپوزيت تشكيل مي دهند. اقدامات آينده شامل آزمايشات درماني، درون بدن و پتانسيل باند شدگي با استخوان اين مواد كامپوزيت شيشه – پليمر است.

-قرارداد الف : فيلم پليمر – سراميك شكل گرفته توسط روش قالب گيري حلال

-پيشگفتار

فيلم هاي نازك پليمر – سراميك را مي توان در ابتدا با ذوب كردن پليمر در يك حلال آلي و سپس اضافه نمودن سراميك مورد نظر در شكل ذره اي، ساخت. سپس به حلال اجازه داده مي‌شود تا تبخير شده و فيلم پليمر – سراميك با ضخامت مطلوب بدست آيد.

 

 

 

 

 

 

-موادMATERIALS                                                                                           

      ­        پليمر (براي مثال لاكتيد، پلي گليكوليد، پلي لاكتيد – كو – گليكوليد)

حلال آلي (براي مثال، كلريد متيلن)

      ­        گرانول هاي سراميك (براي مثال، هيدروكسي آپاتيت، شيشه زيست فعال: اندازه  )

-روشها    METHODS                                                                                        1-كاهش وزن پليمر مطابق نسبت مطلوب (وزن پليمر به حجم حلال).

2- اضافه نمودن حلال آلي به فلاسك ارلن ماير يا بشر با پوشش

3-هم زدن مخلوط پليمر – حلال تا زمان حل شدن پليمر

4-اضافه نمودن گرانول‏هاي سراميك به مخلوط پليمر – حلال

5-عمل تركيب تا زمان توزيع هموژن گرانول‏ها در مخلوط ادامه مي يابد.

6-ريختن محلول حلال – پليمر درون ظرف تفلون تحت هود (هواكش) شيميايي

7-تبخير آرام حلال

-ملاحظات مفيدUSEFUL NOTES                                                          

­    نرخ تبخير، پارامتر كليدي در توليد فيلم هاي نازك هموژن است. فيلم هاي متخلخل را مي توان با شتاب دادن سرعت تبخير حلال شكل داد. براي كاهش نرخ تبخير، ظرف تفلون را مي توان در فريزر  قرار داده و عمل تبخير را در طول شب انجام داد.

-قرارداد ب: ساختارهاي پليمر – سراميك سنتز شده توسط روش تجمع حلال

-پيشگفتار

ساختارهاي پليمر – سراميك پايه ريزي شده براساس ريز كره ها را مي توان بوسيله روش تجمع حلال كه در آن ابتدا ريزكره‏ها از امولسيون هاي سنتي آب، روغن – آب تشكيل مي شوند، ايجاد كرد. سپس ماتريس‏هاي تجمع يافته حلال پليمر – سراميك را مي توان از طريق تركيب حلال، ذرات نمك، گرانول هاي سراميك و ريزدانه‏هاي از پيش سخت شده بدست آورد.اساس ساختار سه بعدي با تخلخل قابل كنترل، بر مبناي تركيب روش فوق با پالايش نمك و فشرده سازي ريز كره‏هاست.

-ساخت ريز كره‏هاFABRICATION OF MICROSPHERES                                - موادMATERIALS                                                                                   

      ­        بطري هاي شيشه اي كوچك بورو سيليكات (با ظرفيت حجم ml 30-10)

      ­        محلول پلي ونيل الكل (PVA) wt 1%

      ­        همزن مكانيكي (حد rpm 1000-100)

      ­        بشر ml 1000

-روشهاMETHODS                                                                                    

1-كاهش وزن پليمر مطابق نسبت مطلوب وزن پليمر به حجم حلال

2-اضافه نمودن پليمر و حلال آلي به بطري كوچك شيشه اي و پوشش

3-هم زدن (چرخاب) مخلوط حلال – پليمر تا زمان حل شدن پليمر.

4-اضافه نمودن قطره اي محلول پليمر به محلول 1% PVA در حال چرخش

5-هم زدن محلول پليمر PVA 1% با دور rpm 300 براي حداقل 4 ساعت براي تبخير حلال

6-جمع آوري ريز كر‏ه‏ها از طريق پالايش (تصفيه) خلاء

7-شستشو با آب يون زدايي شده و خشك سازي در هوا براي حداقل 2 ساعت در دماي اتاق

8-خشك سازي از طريق انجماد ريزكره‏ها براي 24 ساعت ديگر جهت حذف هر گونه حلال باقيمانده

9-ذخيره كردن (نگهداري) ريز كره‏ها در دستگاه خشك ساز قبل از استفاده

- ملاحظات مفيدUSEFUL NOTES                                                                 

   ­    حجم PVA 1% به حجم تركيب پليمر – حلال بستگي دارد. براي مثال با ml20 مخلوط پليمر-حلال، مي بايست ml600 محلول PVA 1% بكار برده شود.

      ­        توزيع نهايي اندازه ريز كره‏ها تابعي از سرعت چرخش (هم زدن) PVA1% است.

-      روش تجمع حلالSOLVENT – AGGREGATION METHOD                         - موادMATERIALS                                                                           

      ­        ريزكره‏هاي پليمربا قطر مشخص (براي مثال g2)

­        حلال آلي (براي مثال، كلريد متيلين ml2)

      ­        ذرات NaCl با اندازه مشخص (براي مثال g2)

      ­        گرانول‏هاي سراميكي با اندازه مورد نظر (براي مثال، هيدروكسي آپاتيت، شيشه زيست فعال g2)

-روشهاMETHODS                                                                                      

1-اندازه گيري مقادير دلخواه ريزكره‏هاي پليمري، NaCl و ذرات سراميك

2-تركيب (مخلوط) خشك ريز كره‏ها، ذرات NaCl و گرانول‏هاي سراميك بر اساس نرخ گزيده شده اوزان

3-افزودن تدريجي مقدار كم حلال در زمان هم زدن تركيب

4-قرار دادن تركيب درقالب تفلون

5-بكارگيري پرس كارور جهت اعمال بار فشاري به قالب

6-خشك سازي ساختارهاي حاصله از طريق انجماد براي 24 ساعت

7-غوطه ور كردن ساختارها در ml300 آب يون زدايي شده براي پالايش زدايي ذرات نمك به مدت حداقل 24 ساعت.

8-خشك سازي ساختارها از طريق انجماد براي 24 ساعت

- ملاحظات مفيدUSEFUL NOTES                                                                

      ­        اندازه بلورهاي NaCl ، ميزان تخلخل واندازه خلل و فرج ساختار سه بعدي راكنترل مي كند.

- قرار داد ج : ساختارهاي پليمر – سراميك سنتز شده بوسيله روش ژل ريزكره

- پيشگفتار

روش ژل ريز كره مشابه تجمع حلال است زيرا بر اساس روش ريز كره پايه ريزي شده است.البته، در اين حالت، در حين فرايند تشكيل ريز كره،كره‏ها قبل ازحذف كامل حلال ايزوله مي شوند. در اين وضعيت ژل شكل، كره‏ها مجتمع شده و يك ساختار سه بعدي را ايجاد ميكنند. ساختار متخلخل را مي توان با افزودن NaCl تو خالي و ذرات سراميك بوجود آورد(شكل 2-61).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

- موادMATERIALS                                                                                       

      ­        حلال آلي (براي مثال، كلريد متيلين ml2)

ذرات NaCl با اندازه هاي مشخص (براي مثال، g2)

گرانول هاي سراميك با اندازه مورد نظر (براي مثال، هيدروكسي آپاتيت، شيشه زيست فعال،g2)

آب يون زدايي شده (براي مثال ml300)

-روشهاMETHODS                                                                                         

1-مراحل 4-1 در قرارداد ب را دنبال مي‏كنيم.

2-محلول پليمر – PVA1% را به مدت 2-1 ساعت هم زده تاژل ريزكره تشكيل شود.

3-بيشتر PVA را حذف كرده و ژل ريز كره PVA+ را به داخل لوله سانتريفوژ منتقل مي كنيم.

4- PVA باقيمانده را پس از ته نشيني ريز كره‏ها در كف لوله خارج مي كنيم.

5-مقادير مورد نياز NaCl و ذرات سراميك را وزن مي كنيم.

6-ژل ريزكره‏ها، ذرات NaCl و گرانول هاي سراميك را بر اساس نرخ اوزان گزينش شده تركيب كرده و هم مي زنيم.

7-تركيب حاصل را در قالب تفلون قرار داده و به مدت 24 ساعت در معرض هوا خشك مي‏كنيم.

8-ساختارهارا ازقالب خارج كرده و در آب يون زدايي شده 37 درجه سانتي گراد به مدت حداقل 24 ساعت غوطه ور مي كنيم تا ذرات NaCl پالايش زدايي شوند.

9-ساختارها را براي 24 ساعت از طريق انجماد خشك مي كنيم.

 

توليد داربست هاي پيلمري:جداسازي فاز

رويون ژانگ و پيتر – اكس – ما

اين فصل شامل روش هاي جديد آماده سازي داربست هاي پليمر زيست تخريب پذير مصنوعي ازمحلول هاي پليمر از طريق جداسازي فاز است. همچنين قراردادهاي مختلف ساخت داربست هاي بسيارمتخلخل مرتبط با فرآيندهاي مختلف جداسازي فاز را دربر مي گيرد. بلورينگي حلال در محلول پليمرموجب جداسازي فاز مايع – جامد مي گردد. اسفنج بدست آمده در اثر فرآيند جدا سازي فاز مايع – جامد داراي مورفولوژي لوله اي شكل ناهمگون با يك ساختار نردباني شكل داخلي است. اسفنج فوق با شبكه اي از خلل و فرج هاي پيوسته توسط القاي گرمايي جدا سازي فاز مايع – مايع ايجاد مي‌شود. ماتريس رشته اي مصنوعي با فيبرهايي با قطري به مقياس نانومتر توسط فرايند القاي گرمايي انعقادthermally induced gelation process)) تهيه مي شوند. ماتريس هاي نانو رشته اي با ساختار ماكرو متخلخل بوسيله تركيب روش پالايش پروژن و فرآيند القاي گرمايي ژلاتين بدست مي آيند. اسفنج هاي متخلخل پليمرهاي زيست تخريب پذير و آپاتيت هاي استخواني معدني شكل توسط فرآيند جدا سازي فاز مايع – جامد و فرآيند زيست تقليدي تهيه مي شوند.

مهندسي بافت يك روش نويد بخش را در توليد گزينه هاي بيولوژيكي براي كاشتني ها و پروتزها ارائه مي دهد. در اين روش وجود يك داربست بسيار متخلخل جهت استقرار سلولها و هدايت رشد آنها و بازسازي بافت در سه بعد الزامي است. پليمرهاي زيست تخريب پذير مصنوعي مانند پلي – ال – لاكتيد اسيد (PLLA)، پلي گليكوليك اسيد (PGA) و پلي دي، ال – لاكتيك اسيد – كو – گليكوليك اسيد (PLGA) به طور گسترده به عنوان داربست هايي براي فراكاشت سلول و مهندسي بافت بكار برده مي شوند. روشهاي مختلفي براي تهيه داربست هاي بسيار متخلخل از اين پليمرهاي زيست تخريب پذير ارائه شده اند. پالايش ذره اي يك روش تاييد شده براي ساخت اسفنج هاي متخلخل در مهندسي بافت است. تكنولوژي‏هاي بافت به طور گسترده در ساخت چهار چوب‏هاي قابل بافت و غير قابل بافت زيست تخريب پذير براي مهندسي بافت بكار برده مي شوند.

براي ساخت داربست ها از روش خشك سازي امولسيون از طريق انجماد، اسفنج سازي گاز و چاپ سه بعدي بهره برده مي‌شود. امروزه روش جديد تهيه داربست هاي پليمري زيست تخريب پذير بسيار متخلخل يعني جدا سازي فاز القاي گرمايي محلول پليمر و انتقال (خارج سازي) بعدي، بسيار مورد توجه است.

فرآيند جداسازي فاز كنترل شده براي سالهاي متمادي براي تهيه غشاهاي متخلخل پليمر بكار برده مي‌شد.جدا سازي فاز محلول پليمر را مي توان به چندين روش ايجاد كرد، كه شامل جدا سازي فاز از طريق غير حلال، جدا سازي فاز از طريق شيميايي، و جدا سازي فاز از طريق گرمايي (TIPS) مي‌شود. در فرآيند TIPS كه يك روش نسبتاً جديد براي تهيه غشاهاي متخلخل است، دماي محلول پليمر كاهش يافته و جداسازي فاز رخ مي دهد كه فاز اول آن داراي غلظت پليمر بالا (فاز غني از پليمر) و فاز دوم داراي غلظت پليمر كم (فاز عادي از پليمر) است. بعد از خارج سازي حلال از طريق عصاره گيري، تبخير يا تصعيد، پليمر موجود در فاز غني از پليمر به شكل اسكلت سخت شده و فضاهاي اشغال شده در ابتدا توسط حلال، در فاز عادي از پليمر به صورت خلل و فرج اسفنج پليمر در مي آيند. موفولوژي غشاء متخلخل متناسب با پليمر، حلال، غلظت محلول پليمر و دماي جداسازي فاز، تغيير مي كند. غشاهاي بدست آمده از اين فرآيند معمولاً داراي خلل و فرجي با قطر چندين ميكرومتر بوده و معمولاً براي داربست‏هاي مهندسي بافت مناسب نيستند. يك داربست بايد داراي خلل و فرج هايي به اندازه كافي بزرگ براي كاشت سلول و سطحي به اندازه كافي وسيع براي چسبندگي سلول و همچنين افشانندگي(diffusivity) مناسب براي تراوش (نفوذ) مواد غذايي و متابوليت ها باشد. ما در اين فصل بر توسعه روش هاي جداسازي فاز القاي گرمايي براي ساخت داربست هايي با مورفولوژي و خصوصيات تخلخلي كنترل شده براي فراكاشت سلول و كاربردهاي مهندسي بافت تاكيد مي كنيم (شكل1-62). قراردادهاي توسعه يافته در آزمايشگاه ما به عنوان مثالهايي براي شرح اين مباحث بكار برده مي شوند.

 

 

 

 

 

-پليمرهاPOLYMERS                                                                                      

پلي – ال – لاكتيد اسيد (PLLA)، پلي دي، ال – لاكتيك اسيد – كو – گليكوليك اسيد (15/85) (PLGA85) و پلي دي، ال – لاكتيك اسيد – كو – گليكوليك اسيد (50:50) (PLGA50) با وسيكوزيته ذاتي در حدود 6/1 ، 4/1 و 5/0 از بهرينگر اينگلهايم (اينگلهايم، آلمان).

پلي دي، ال – لاكتيك اسيد – كو – گليكوليك اسيد (25 : 75) (PLGA75) و ويسكوزيته ذاتي 65/0-5/0 از موسسه بين المللي تكنولوژي هاي مديزورب (سينسيناتي، OH (ايالت اوهايو)

پلي دي ال – لاكتيد (PDLLA) با وزن مولكول 103000 از شركت شيميايي سيگما (سنت لوئيس، MO (ايالت ميسوري))

- حلال هاSOLVENTS                                                                                        ديوكسان، تتراهيدروفوران –N , N , (THF) دي متيل فور ماميد (DMF)، پريدين، متانول و بنزن از شركت شيميايي آلدريش (ميلواكي، WI (ايالت ويسكانسين) هيدروكسي آپاتيت  (HAP)، و كليه نمك ها براي تهيه مايع شبيه سازي شده بدني (SBF) از آلدريچ.

جداسازي فاز القاي گرمايي بر اساس رفتار جنبشي و ترموديناميك محلول پليمر با تغيير دماي محلول عمل كرده و يك فرآيند پيچيده است. بلورينگ حلال در زمان كاهش دما مي تواند موجب جداسازي فاز محلول پليمر شود. اين فرآيند جداسازي فاز را تحت عنوان فرآيند جداسازي فاز مايع- جامد تعريف مي كنيم. در اين حالت، دماي بلورينگي (نقطه انجماد) حلال بالاتر از دماي جداسازي فاز مايع – مايع محلول پليمر است. هنگامي كه دماي محلول كاهش مي يابد، حلال به شكل بلور درآمده و پليمر از سطح آن خارج مي‌شود كه همان جدا سازي فاز جامد – مايع محلول پليمر است. مورفولوژي بلورهاي حلال با حلال بكار رفته، غلظت پليمر و دماي بلورينگي وگراديان دماي اعمال شده به محلول پليمر تغيير مي كند. اسفنج‏هايي با مورفولوژي تخلخل متنوع به شل مدل‏هاي منفي بلورهاي حلال قابل حصول است.

اسفنج PLLA و PLGA از طريق جداسازي فاز مايع – جامد بوسيله كاهش دماي محلول پليمر و جهت ايجاد بلورينگي حلال و تصعيد متعاقب حلال تهيه مي‌شود. عموماً، در تهيه اسفنج مراحل ذيل طي مي‌شود. در ابتدا پليمر گزينش شده تحت چرخش مغناطيسي در دماي C50 به مدت 2 ساعت در حلال (اغلب، دي اكسين) حل مي شد. سپس ml2 محلول پليمر – دي اكسين به ظرف تفلون اضافه مي گردد (ml5، كه قبلاً تا دماي C50، گرم شده است) و حل مي‌شود.

ظرف حاوي محلول به سرعت به يخچال يا فريزر با دماي از پيش تنظيم شده منتقل مي‌شود تا حلال سخت شده و موجب جداسازي فاز مايع – جامد شود. تركيب سخت شده به مدت 2 ساعت سرد نگهداري شده و سپس به ظرف انجماد – خشك سازي، حمام نمك – يخ در دماي بين C5- و C10- منتقل مي‌شود. نمونه ها سپس از طريق انجماد mmHg5/0 براي حداقل يك هفته خشك مي شوند تا از حذف كامل حلال مطمئن شويم.

اسفنج هاي بدست آمده از جداسازي فاز مايع – جامد محلول پليمر داراي مورفولوژي لوله اي بسيار ناهمگون، با ساختار داخلي نردباني شكل هستند (شكل 2-62). در اين روش، كانال ها موازي با جهت سخت شدن (جهت انتقال گرما) بوده و داراي بخش ‏هاي تكراري با فاصله هاي يكنواخت عمود بر جهت سخت شدن (استحكام) هستند. قطر كانال‏ها و فاصل بين بخش هاي تكراري در كانال با نرخ سرد شدن و غلظت پليمر و حلال مورد استفاده تغيير مي كند. براي يك سيستم حلال – پليمر، اندازه متوسط خلل و فرج با كاهش يافتن دما، زياد مي‌شود.

ساختار خلل و فرج بدست آمده از اين پردازش به بلورينگي حلال بستگي دارد. زماني كه دماي محلول پليمر كمتر از نقطه انجماد (دماي بلورينگي) حلال () باشد، حلال به شكل بلور در آمده و فاز پليمر به صورت ناخالصي از سطح بلورينگي خارج مي‌شود. فاز پيوسته غني از پليمر در اثر تجمع پليمر خارج شده از هر بلور منفرد حلال شكل مي گيرد. پس از تصعيد بلورهاي حلال، اسفنجي با مورفولوژي خلل و فرج هايي به شكل اثر انگشت بلورهاي حلال ايجاد مي‌شود. گراديان دما در امتداد مسير سخت شدن (استحكام) (از سطح نمونه تا مركز نمونه) مي تواند منجر به ساختار بسيار ناهمگون خلل و فرج شود.

-تهيه ماتريس هاي كامپوزيت پليمر-HAP

اسفنج هاي كامپوزيت پليمر وهيدروكسي اپتيت را مي توان با جداسازي فاز مايع – جامد تركيب حلال – پليمر-  HAPو تصعيد متعاقب حلال توليد كرد. تركيب حلال – پليمر – HAP از طريق اضافه نمودن پودر HAP به محلول پليمر بدست آمده، تهيه مي‌شود. اين تركيب در طول شب در دماي اطاق چرخانده شده تا يك تركيب هموژن بدست آيد. سپس تركيب تا زمان القاي جداسازي فاز سردشده و حلال مانند فرايند ذكر شده براي ماتريس‏هاي پليمر تحت خلاء تصعيد مي‌شود. در اين روند، ml2 تركيب دي اكسين – PLLA-HAP بجاي محلول پليمر در ظرف تفلون بكار مي رود تا اسفنج كامپوزيت بدست آيد. تركيب نهايي اسفنج كامپوزيت HAP-PLLA بوسيله غلظت محلول پليمر و مقدار HAP در تركيب تعيين مي‌شود.

روش جدا سازي فاز مايع – جامد، يك ساختار پيوسته از خلل، فرج‏هاي نامنظم متصل به هم در اسفنج پليمر- HAP كه با اسفنج پليمري خالص بسيار تفاوت دارد ايجاد مي كند (شكل 3-62). اندازه خلل و فرج هاي نامنظم از چندين ميكرومتر تا حدود 300 است. ديواره خلل و فرج ها از پليمر و HAP تشكيل شده است.

 

 

 

 

 

ذرات HAP افزوده شده به محلول پليمر، بلورينگي حلال را به هم زده و با تاخير انداختن در رشد بلور، بلورينگي حلال را تغيير مي دهد و در نتيجه منجر به شكل گيري بلورهاي نامنظم بيشتري مي‌شود. از طرف ديگر، هم ذرات HAP و هم پليمر از سطح بلورينگي خارج شده و فاز غني از پليمر- HAP را ايجاد مي كند. ذرات HAP به طور تصادفي در ماتريس پليمر توزيع مي شوند. بعد از تصعيد حلال، فاز غني از پليمر-  HAP چارچوب پيوسته اسفنج پليمر – HAP را تشكيل داده و فضاهاي اشغال شده اوليه توسط بلورهاي حلال بصورت خلل و فرج هاي اسفنج درمي آيند. در نتيجه رشد نامنظم بلور حلال، خلل و فرج هاي نامنظم موفولوژي غالب اسفنج كامپوزيت پليمر- HAP را ايجاد مي كنند.

در فرآيند جداسازي فاز مايع – جامد، ميكروساختار اسفنج كامپوزيت را مي توان با تغيير غلظت پليمر، مقدار HAP، دماي فرونشاني، پليمر، و حلال بكار رفته كنترل كرد. هم اندازه خلل و فرج و هم ميزان تخلخل با كاهش غلظت پليمر و مقدار HAP افزايش مي يابد. همچنين، خصوصيات مكانيكي اسفنج هاي كامپوزيت بطور قابل ملاحظه اي نسبت به اسفنج هاي پليمري خالص بهبود مي يابد. كامپوزيت‏هاي حاوي HAP، موادي با خصوصيات هدايت استخواني خوب بوده و داربست هاي مناسبي براي مهندسي بافت استخوان به شمار مي روند.

 

 

 

 

 

PREPARATION OF POLYMER-APATITE COMPOSITE MATRICES BY A BIOMIMETIC PROCESS                                                                    

فرآيند زيست تقليدي جهت شكل دهي آپاتيت در اسفنج هاي پليمري بدست آمده از جداسازي فاز جامد- مايع بكار برده مي‌شود. اسفنج هاي پليمري توسط جدا سازي فاز جامد- مايع كه در ارتباط با ماتريس‏هاي پليمر تشريح شد، تهيه مي شوند. مايع شبيه سازي شده بدن (SBF) با حل كردن مواد شيميايي با درجه معرف
(Na₂So4, CaCl₂, MgCl₂ .6H₂O , K₂HPO₄. 3H₂O, KCl, NaHCo₃ ,NaCl) در آب يون زدايي شده تهيه مي شود، و غلظت هاي يون غير آلي آنها 5/1 برابر پلاسماي خون انسان است. اين مايع در PH برابر 4/7 در با تريس (هيدرو كسي متيل) آمينومتان  و اسيد هيدروكلريك (HCl) تثبيت مي‌شود. پنج گونه اسفنج پليمري مثلث شكل با ابعاد mm6*mm8*mm12 در ml100 SBF كه در يك بطري شيشه اي حفظ شده است، در دماي  غوطه ور مي شوند. SBF هر يك روز در ميان عوض مي‌شود. بعد از نگهداري در مدت زمان هاي مختلف، گونه ها از مايع خارج شده و در طول يك شب در ml100 آب يون زدايي شده غوطه ور مي شوند تا يون‏هاي غير- آلي قابل حل خارج شوند، سپس در دماي اتاق خشك مي‌شود.

 

 

 

 

 

 

اسفنج كامپوزيت بدست آمده داراي تعداد زيادي ميكرو ذرات آپاتيت رشد يافته بر روي سطوح ديواره هاي خلل و فرج است (شكل 4-62). ذرات آپاتيت مشابه آپاتيت استخوان طبيعي در تركيبات و ساختارهاي تشريح شده با ميكروسكوپي اسكن الكتروني (SEM)، اسپكتروسكوپي تفرق انرژي (EDS)، انكسار اشعه X (XRD) و تحليل تبديل فوريه (FTIR) IR مي باشد. تعداد و اندازه ذرات با فاكتورهاي مختلفي مانند، زمان نگهداري، غلظت يوني SBF، ناحيه سطح پليمر و اصلاح سطح، كنترل مي شوند. چگالي (تعداد ذرات در واحد سطح)، قطر متوسط ذره و جرم كل آپاتيت با زمان نگهداري افزايش مي يابد. خصوصيات مكانيكي اين ماتريس كامپوزيت جديد بطور قابل ملاحظه اي نسبت به ماتريس پليمر خالص اصلاح شده و نيز با زمان نگهداري افزايش مي يابد. از آنجا كه ذرات آپاتيت بر روي ديواره هاي خلل و فرج تقليدي از استخوان معدني تشكيل مي شوند، انتظار بهبود هدايت استخواني مي رود.

-جداسازي فاز مايع – مايعLIQUID – LIQUID PHASE SEPARATION              زماني كه دماي بلورنيگي حلال بسيار كمتر از دماي جداسازي فاز محلول پليمر آمورف باشد، در اثر كاهش دماي محلول پليمر نسبت به بالاترين دماي بحراني محلول، تفكيك فاز مايع – مايع رخ مي دهد. شكل 5-62، نمودار يك فاز تعادلي معمولي سيستم محلول پليمر آمورف را نشان مي دهد. منحني اسپينودال منطقه تفكيك فاز مايع – مايع را به دو ناحيه ترموديناميكي فراپايدار(ناحيه بين بينودال اسپينودال) و ناحيه ترموديناميكي ناپايدار (ناحيه محدود شده توسط اسپينودال) تقسيم مي كند.

زماني كه يك محلول پليمر هموژن در اثر يكي از دو مكانيزم: هسته اي شدن و رويش يا تجزيه اسپينودال، تا دماي تركيب كمتر از دماي تجزيه بينودال سرد شود، نيرويي به وجود خواهد آمد كه منجر به تفكيك سيستم به دو فاز غني از پليمر و عاري از پليمر مي‌شود. در يك محلول پليمر با غلظت بسيار كم، زماني كه نقطه دماي تركيب زير ناحيه فرا پايدار قرار گيرد، آرايش ساختار ممكن حاوي قطرات فاز غني از پليمر پراكنده در ماتريس فاز عاري از پليمر مي‌شود. در اين حالت پس از خارج سازي حلال، پليمر جامد پودري شكل بدست مي آيد (شكل 1-62). زماني كه نقطه دماي تركيب زير ناحيه ناپايدار قرار گيرد، ساختار زيست پيوسته اي بدست مي آيد كه در آن فاز غني از پليمر و فاز عاري از پليمر كاملاً با هم پيوند خورده اند كه اين وضعيت در اثر تجزيه اسپينودال خواهد بود. اسفنجهاي با ساختار شبكه خلل و فرجي پيوسته، پس از حذف حلال از اين سيستم تفكيك فازي بدست مي آيند (شكل 1-62) زماني كه نقطه دماي تركيب زير ناحيه فرا پايدار محلول پرغلظت پليمر قرار گيرد، قطرات فاز عاري از پليمر در ماتريس فاز غني از پليمر شكل گرفته و اسفنجي با ساختار خلل و فرج بسته بدست مي آيد. (شكل 1-62)

 

 

 

 

 

در يك محلول پليمر نيمه بلورين، تفكيك فازي به سبب بلورينگي پليمر بسيار پيچيده‏تر است. اگر دماي محلول پليمر به اندازه كافي پايين باشد، محلول دچار نيروهاي رانش براي تفكيك فاز مايع – مايع و بلورينگي پليمر شده و ساختار نهايي سيستم را تعيين مي‏كند بطور كلي، تفكيك فاز مايع – مايع سريعتر از بلورينگي پليمر اتفاق مي افتد. محلول در ابتدا تفكيك فاز مايع – مايع را تجربه كرده و سپس بلورينگي پليمر در فاز غني از پليمر رخ مي دهد كه مورفولوژي محلول تفكيك فاز اساساً به تفكيك فاز مايع مايع بستگي پيدا مي كند. در برخي موارد، محلول پليمر در خلال فرآيند سردسازي به شكل ژل در ميآيد. ژل شدگي فرآيندي است كه در آن كل محلول پليمر به شكل ژل كه شبكه اي از زنجيره هاي پليمري همبر(cross-linked) با حلال به دام افتاده در شبكه است سخت مي‌شود. در يك محلول پليمري نيمه بلورين، چفت شدگي توده هاي كوچك بلور، در شكل گيري ژل نقش كليدي بازي مي كنند. در اثر حذف حلال از ژل ساختار بسيار متخلخلي بدست مي آيد.

زماني كه دماي بلورينگي پليمر بالاتر از دماي اسپينو دال باشد، بلورينگي پليمر در محلول قبل از تفكيك فاز اسپينودال در طول فرآيند سردسازي رخ مي دهد. اگر محلول پليمر به اندازه كافي در دماي بالاتر از دماي اسپينودال نگهداري شود، محلول دچار تفكيك فاز القاي بلورينگي شده كه نوعي ديگر از تفكيك فاز مايع – جامد است. فاز غني از پليمر توسط هسته اي شدن و رويش بلورهاي پليمر ايجاد مي‌شود. پليمر پلاكت شكل در ماتريس فاز عاري از پليمر به حالت تعليق درامده و يا به سرعت د محلول ته نشين مي‌شود. زماني كه غلظت پليمر به اندازه كافي بالا باشد، عمل ژل شدگي نيز در فرآيند فاز تفكيك رخ مي دهد كه از آن مي توان براي ساخت اسفنج هاي پليمري استفاده كرد.

 

-تهيه ماتريس هاي پيوسته شبكه پليمر

تفكيك فاز مايع – مايع القا شده گرمايي محلول پليمر را مي توان با انتخاب يك حلال با نقطه انجماد پايين تر از دماي تفكيك فاز محلول پليمر ايجاد كرد. براي پلي  - هيدروكسيل اسيدها، تركيب دي اكسين و آب براي دستيابي به تفكيك فاز مايع – مايع بكاربرده مي‌شود. يك محلول پليمر صاف، (كه قبلا تا دماي 60C گرم شده باشد) تا دماي از قبل تعيين شده سرد گشته تا عمل تفكيك فاز مايع – مايع صورت گيرد. سپس محلول منجمد شده به داخل ظرف خشك سازي – انجماد، در دماي بين 5C- و 10C- در حمام يخ – نمك منتقل مي‌شود. بعد از خشك سازي از طريق انجماد براي يك هفته در mmHg5/0، حلال كاملاً خارج شده و اسفنجي متخلخل باقي مي ماند.

 

 

 

 

 

بسته به اينكه تفكيك فاز در كدام قسمت نمودار فاز دما – تركيب محلول پلير رخ دهد، از طريق تفكيك فاز مايع – مايع مي توان، هم ماده پودري شكل و هم اسفنجي با شبكه خلل و فرج پيوسته همگن بدست آورد (شكل 6-62). ساختار نهايي ماتريس حاصل از تفكيك فاز مايع – مايع به غلظت محلول پليمر، دماي فرونشاني               (quenching temperature) و وزن مولكولي پليمر بستگي دارد. بطور كلي، ساختار پودر شكل از محلول پليمر با غلظت بسيار كم بدست مي آيد در حاليكه اسفنج با ساختار خلل و فرج همگن از محلول پليمري كه داراي غلظت نسبتا بالاتر است حاصل مي‌شود. در غلظت يكسان، پليمري كه داراي وزن مولكولي بالاتري است براي ايجاد آرايش ساختار يكنواخت خلل و فرج همگن مطلوب تر است. در يك محدوده غلظت مشخص پليمر، دماي فرونشاني كمتر (نرخ سرد سازي بالاتر) معمولاً منجر به ايجاد شبكه خلل و فرج در هم با اندازه خلل و فرج يكنواخت مي‌شود. دماي فرونشاني بالاتر (نرخ سرد سازي پايين تر) منجر به خلل و فرج هاي بزرگ تر با توزيع اندازه خلل و فرج وسيع تر مي گردد.

اندازه خلل و فرج اسفنج از تفكيك فاز مايع – مايع بدست آمده كه معمولاً از چندين ميكرومتر تا چند ده ميكرومتر است. فاز تفكيك شده غير دقيق (نامرغوب) در طول مراحل پاياني تفكيك فازي فاكتور ديگر است كه بر مورفولوژي فاز سيستم تاثير مي گذارد. زماني كه نمونه در دماي تفكيك فازي قرار مي گيرد، اندازه متوسط قطرات متناسب با كاهش تعداد قطرات در واحد حجم ميل به افزايش مي يابند، نيروي رانش براي چنين افزايشي در اندازه متوسط قطرات، تمايل سيستم در كمينه كردن انرژي آزاد بين سطحي يا به حداقل رساندن سطح درون لايه اي بين فازهاي غني از پليمر و عاري از پليمر است. اين پديده را مي توان براي كنترل اندازه خلل و فرج اسفنج هاي تهيه شده از تفكيك فاز مايع – مايع، بخصوص براي ساختارهاي متخلخل داربست هاي پليمري مهندسي بافت كه در آنها اندازه مناسب خلل و فرج براي كاشت سلول الزامي است بكار برد.

-تهيه ماتريس هاي پليمري با شبكه نانو رشته اي

PREPARATION OF POLYMER MATRICES WITH NANOFIBROUS NETWORK

براي تهيه ماتريس هاي نانو رشته اي PLLA بسيار متخلخل از محلول PLLA القاء شده انعقاد گرمايي بايد سيستم حلال مناسب انتخاب شود. بطور كلي، مراحل پردازش عبارتند از:

1-محلول ml2 PLLA (كه قبلاً تا دماي C50 گرم شده باشد) به ظرف تفلون اضافه مي‌شود. ظرف حاوي محلول PLLA بلافاصله در يخچال يا فريزر با دماي از پيش تعيين شده براي ژل شدن قرار داده مي‌شود. سيستم هاي حلال مختلفي (از جمله THF ، DMF ، پيريدين، THF- متانول، دي اكسين – متانول، دي اكسين-H₂O ، دي اكسين – استون) براي تهيه ژل هاي پليمر بكار برده مي‌شود. زمان ژل سازي به دما، حلال و غلظت PLLA محلول بستگي دارد. بعد از ژل شدگي و قبل از شروع مرحله بعدي، ژل در دماي ژلاتيني براي 2 ساعت ديگر نگهداري مي‌شود.

2-ظرف حاوي ژل براي تعويض حلال در آب مقطر غوطه ور مي‌شود. آب سه بار در روز و به مدت 2 روز عوض مي گردد.

3-سپس ژل از آب خارج شده و توسط تكه كاغذ صافي پالايش مي‌شود و در دماي C20- به مدت 2 ساعت در فريزر قرار مي گيرد.

4-ژل منجمد شده را در ظرف خشك ساز – انجماد در دماي 5- تا C10- در حمام يخ –نمك قرارداده و سپس تحت خلاء (mmHg5/0(< براي يك هفته از طريق انجماد خشك مي كنيم.

 

 

 

 

از طريق فرآيند ژل سازي، مي توان شبكه هاي سه بعدي نانو رشته اي را از محلول PLLA بدست آورد (شكل 7-62). شبكه رشته اي داراي رشته هايي (فيبرهايي) با قطر 50 تا mm500 است. آرايش شبكه اي رشته ها به دماي ژل سازي حلال محلول PLLA بستگي دارد. بطور كلي، در دماي ژل سازي پايين، ساختار نانو رشته اي، شكل مي گيرد. همچنين دماي ژل سازي براي ساختار رشته اي بستگي به حلال بكار رفته دارد. براي يك محلول PLLA-THF ، دماي ژل سازي براي تشكيل ساختار نانو رشته‏اي بايد كمتر از حدود C15 باشد. تخلخل ماتريس نانو رشته اي با افزايش غلظت پليمر كاهش مي يابد در حاليكه خصوصيات مكانيكي (از قبيل مدول يانگ و استحكام كششي) با غلظت پليمر افزايش مي يابد.

فرآيند ژل سازي ساخت ماتريس هاي رشته اي داراي مزاياي مختلفي است. كه از آنجمله عدم نياز به تجهيزات مي باشد كه بر عكس روش ساخت پارچه‏هاي غير بافتي با تكنولوژي نساجي است. اين فرآيند همچنين بسيار ساده تر است. ايجاد رشته هايي با قطر مشابه ماتريس هاي برون سلولي طبيعي با واحد نانومتر در تكنولوژي نساجي بسيار مشكل و يا حتي غيرممكن است. اين فرآيند را مي توان بوسيله قالب، مستقيماً براي ساخت داربست به شكل آناتومي قسمتي از بدن بكار برد. نرخ سطح به حجم در اين روش بسيار بالاتر از آن دسته پارچه هاي رشته اي غير بافتي تكنولوژي نساجي يا اسفنج هاي ساخته شده با روش هاي ديگر است.

هر چقدر كه مساحت سطح بالاتر باشد، چسبندگي سلول افزايش مي يابد. براي بسياري از انواع سلولها جابجايي سلول، رشد و عملكردهاي متمايز سلول، همگي بستگي به چسبندگي سلول دارند. بنابراين ماتريس هاي برون سلولي غير بافتي مصنوعي شرايط (محيط) بهتري براي چسبندگي، تكثير و عملكرد سلول فراهم مي كنند.

-تهيه ماتريس هاي پليمري با ساختار پلاكت شكل

PREPARATION OF POLYMER MATRICES WITH PLATELETLIKE STRUCTURE

ماتريس PLLA بسيار متخلخل با ساختار پلاكت شكل از القاي گرمايي ژلاتيني محلول PLLA در دماي نسبتاً بالا تهيه مي شوند. همچنين حلال هاي بكار رفته در تهيه ماتريس هاي نانو رشته اي را مي توان جهت ساخت ماتريس هايي با ساختار پلاكت شكل نيز بكار برد. فرآيند تهيه اسفنج ها با ساختار پلاكت شكل مشابه آن چيزي است كه در رابطه با شبكه هاي نانو رشته اي توصيف شده البته، دماي ژل سازي بايد متناسب با حلال بكار رفته، بالاتر باشد. براي يك محلول PLLA-THF، اسفنج هاي با ساختار پلاكت شكل در دماي ژل سازي بالاتر از C20 شكل مي گيرند (شكل 8-62). هسته سازي و رشد بلورهاي PLLA در دماي بالاتر از دماي تفكيك فاز اسپينودال مي توان سبب شكل گيري ساختار پلاكت شكل شود.

 

 

 

 

 

-تهيه ماتريس هاي نانو رشته اي با ساختار ماكرو متخلخل

ماتريس رشته اي سه بعدي تهيه شده از ژلاتين محلول PLLA داراي خلل و فرج هايي با اندازه متوسط (فاصله بين رشته ها) چندين ميكرومتر هستند. البته، داربست هاي مهندسي بافت بايد داراي خلل و فرج هاي حداقل چند ده ميكرومتر باشند تا به خوبي دانه هاي سلول را در خود جاي دهند. براي بدست آوردن داربست هايي با ساختار نانو رشته اي و خلل و فرج هايي به اندازه كافي بزرگ براي كشت سلولي، تركيبي از روش‏هاي ژل سازي و پالايش پروژن بكار برده مي‌شود.

ذرات شكر به عنوان پروژن براي تهيه داربست هايي با ساختار نانو رشته اي و معماري ماكرو متخلخل به كار برده مي شوند. محلول پليمر از پيش گرم شده به آرامي بر روي ذرات شكر در قالب چكانده شده و سپس تا دماي ژلاتيني از پيش تعيين شده سرد مي‌شود. سپس كامپوزيت ژل – شكر در آب مقطر غوطه ور شده تا خروج حلال و پالايش شكر از كامپوزيت به طور همزمان انجام گيرد. ژل بعد از 4 روز از آب خارج شده و با كاغذ صافي پاك گرديده و به مدت 2 ساعت در دماي C20- در فريزر قرار داده مي‌شود. ژل منجمد شده در دماي 5- تا C10- در حمام يخ – نمك تحت خلاء (mmHg5/0<) براي يك هفته از طريق انجماد خشك مي‌شود. با تركيب روش ژل سازي و پالايش پروژن، يك ماتريس سه بعدي با معماري ماكرو متخلخل از كامپوزيت شكر – PLLA تهيه مي‌شود. (شكل 9-62).

برخلاف ديواره خلل و فرج اسفنج هاي تهيه شده با روش سنتي پالايش نمك، ديواره خلل وفرج ماتريس هاي جديد داراي شبكه نانو رشته اي است. ميكرو ساختار رشته اي به عنوان داربستي براي مهندسي بافت مي تواند چسبندگي سلول ها را افزايش داده و ساختمان ماكرو متخلخل آن، ساختار متخلخلي ايجاد مي كند كه براي توزيع فضايي سلول مطلوب است.

 

توليد داربست هاي پليمري: پليمريزاسيون (بسپارش)

PROCESSING OF POLYMER SCAFFOLDS : POLYMERIZATION

تهيه تركيب منومر ساده است: ابتدا همه سيالات فهرست شده در جدول 1-63 را به غير از عامل شتاب دهنده ( - تترامتيل اتيلن ديامين، TEMED ) در ظرف شيشه اي به هم اضافه مي كنيم. ظرف را به مدت 3 دقيقه در حمام اولتراسونيك- قرار مي دهيم و مراقب هستيم تا دماي حمام ثابت باقي بماند. بعد از اضافه كردن عامل شتاب دهنده، تركيب را براي 30 ثانيه به آرامي تكان داده يا مي غلطانيم. از حركت شديد و تند خودداري مي كنيم زيرا كه ممكن است سبب ورود اكسيژن به داخل تركيب شده و جنبش بسپارش را تغيير دهد. فرمولاسيون فوق را مي توان اكنون به داخل قالب تزريق كرد.

-اعمال-تزريق فرمولاسيون به قالب

فرمولاسيون به دست آمده را ميتوان با يك سرنگ يك بار مصرف با سوزن درجه 18 به قالب مورد نظر كه داراي شكل و ابعاد مطلوب محصول نهايي است تزريق نمود. جلوگري از ايجاد حباب در زمان تزريق فرمولاسيون از اهميت ويژه اي برخوردار است. فرمولاسيون بايد قبل از رخ دادن تفكيك فاز (به عبارت ديگر سفيد شدگي) تزريق شود.

-بسپارش و تشكيل داربست

از آنجا كه دما بر جنبش بسپارش تأثير مي گذارد حفظ دماي ثابت قالب در طول بسپارش ضروري است. زمان بسپارش در حدود 10-2 ساعت در دماي اتاق بوده و به تركيب دقيق فرمولاسيون بستگي دارد. فرمولاسيون هاي حاوي آغاز كننده ها و يا عامل هاي شبكه ساز كمتر معمولاً به زمان بيشتري براي شكل گيري قالب نياز دارد. قالب ها معمولاً در طول شب باقي مانده و يا در فري با دماي C ^{0 nm550 پس از 60-5 دقيقه (به عكس العمل كنتيك ها بستگي دارد) تشخيص داد. استفاده از كووت هاي پلي استايرن يك بار مصرف براي سنجش نور بهترين انتخاب است چرا كه پليمر به سطوح كوارتز مي چسبد. بعد از تفكيك فاز، تركيب در حالت سيال باقي مانده تا ذرات ژل فاز كه متناسب با كنتيك ها مي توانند از 30 ثانيه تا 1 ساعت زمان اضافي ببرند جدا شود. توجه به اين نكته مهم است كه بدانيم داربست نتيجه تفكيك فازي و سپس ژل شدگي است و اگر اين ترتيب برعكس شود به جاي داربست ژل به دست مي آيد. تغيير فاز در 75% آب در زمان وقوع ژل شدگي قبل از تفكيك فاز سبب غير قابل نفوذ شدن ژل ها در برابر سلول ها مي شود. بنابراين بهترين وضعيت حفظ تعادل 80% آب در فرمولاسيون است تا حالت نفوذ پذيري داربست در برابر سلول حفظ شود. محدوده اندازه خلل و فرج متناسب با فرمولاسيون از 2 تا 80 تغيير مي‌كند.}50 به مدت 3 ساعت پس از سپري شدن 10-2 ساعت نخستين از تبديل كامل و باقي ماندن كمترين ميزان منومرها قرار داده مي شود. تفكيك فاز و ژل سازي دو تغير فيزيكي هستند كه در حين بسپارش قابل مشاهده هستند. تفكيك فاز يا سفيد شدگي فرمولاسيون را مي توان با طيف سنجي در

-استخراج ساكس هلت داربست

SOXHLET EXTRACTION OF SCAFFOLD                                                  تحقيقات چيفكوفي و همكارانش نشان داد كه آ‎ب استخراج شده از ژل هاي PHEMA و تزريق شده به درون پوست موش ها نسبتاً دردناك است. بنابراين خارج كردن همه عوال سمي از اسفنج هاي PHEM قبل از اعمال به بافت بسيار مهم است. همچنين اگر اكريلاميد كه يك نورو توكسين قدرتمند است يك كومونومور باشد اهميت دوچندان مي شود. روش استخراج ساكس هلت راحت ترين و مؤثرترين شيوه براي خارج سازي مونور باقيمانده و يا هر آغاز گر غير فعال ديگري است. نمونه هاي كوچك را مي توان در انگشتانه يا كاست رشد قرار داده تا از كشيده شدن آنها به درون جريان خروجي محفظه نمونه جلوگيري كرد. اگر اسفنج هاي اصلاح شده نسبت به دما حساس بوه و يا شامل ذرات تخريب پذير باشند مي توان استخراج را در دماي پائين توسط دستگاه جانبي سردساز متصل به محفظه نمونه يا با سيستم ساكس هلت به اجرا در آورد. در زمان كار تحت خلاء از تطبيق ساز مدخل مويرگ خوني در يك فلاسك با كف گرد و دو گردنه جهت توليد رشته اي از حباب هاي هوا براي جلوگيري از ضربه استفاده مي شود. استخراج اسفنج هاي PHEM معمولاً درطول شب انجام مي شود. حداقل تعداد شستشوهاي ضروري براي خارج كردن اجزا سمي نامشخص است اما مقدار يك يا دو استخراج ml40 شايد كافي باشد. از روغن كاري بين مفاصل كاملاً حذر كرده و چربي احتمالي را با كلروفرم يا استون به خوبي پاك مي كنيم.

-استريليزاسيون (سترون كردن)STERILIZATION                                         اسفنج هاي PHEMA را ميتوان تحت اتوكلاو قرار داده و ترجيحاً در آب داخل محفظه درب دار غير پيچشي براي جلوگيري از افزايش فشار، غوطه ور ساخت. اسفنج هاي PHEMA در اثر حضور در چنين دماهايي كمترين تخريب را از خود نشان مي دهند. از پرتودهي گاما ، (KGy 25) نيز مي توان بهره گرفت. التبه احتمال تغيير جزئي حجم شبكه يا بريدگي زنجير وجود دارد.

-نفوذ سلولي داربست هاCELLULAR PENETRATION OF SCAFFOLDS    روش هاي استاندارد كشت سلولي را مي توان براي كاشت اسفنج هاPHEMA استريل در محل بافت مورد نظر يا بارور كردن آنها با سلول ها براي كشت آزمايشگاهي به كار برد. براي بالا بردن نفوذ سلولي اسفنج هاي PHEMA مي توان «پوسته» متخلخل كمتري كه نمونه قالب گيري شده را احاطه كرده است برداشت. اين كار را مي توان با ماشين تراش (بر روي نمونه هاي منجمد) يا توسط تيغ (داربست هاي نيمه منجمد شده در دماي C⁰ 78- به مدت 10 دقيقه) انجام داد. از غوطه ور شدن اسفنج ها در نيتروژن مايع بايد حذر كرد چرا كه سبب از هم پاشيدن اسفنج مي شود. البته اين روش براي تصوير برداري ميكروسكوپي اسكن الكترون (SEM) مي تواند مفيد باشد. (استخراج ساكس هلت، ترك خوردگي را كاهش مي دهد) مطلوب است كه اسفنج هاي PHEMA ساخته شده در حمام اولتراسونيك بدون پوسته باشند. البته گرماي توليد شده در سونيكاتور مي تواند بر جنبش بسپارش اثر بگذارد.

-پردازش ساختار بافتHISTOLOGICAL PROCESSING                               مورفولوژي كلي و تغييرات فوق ساختاري در برون كاشتي ها يا اسفنج هاي كشت شده PHEMA را ميتوان توسط ميكروسكوپ چشمي و ميكروسكوپ انتقال الكترون (TEM) بر بافت پردازش شده در صمغ اپوكسي مشاهده كرد. كاشتني هاي خارج شده از بدن بايد به مدت 48-24 ساعت در 5/2% گلوتارآلدهيد نگهداري شده و از قبل در 1% اسميوم تتراكسايد تثبيت شوند. نمونه ها توسط محلول هاي درجه بندي شده اتانول آب گيري شده و سپس در اكسيد پروپيلن غوطه ور مي شوند. سپس نمونه به وسيله صمغ اپوكسي و تعويض روزانه صمغ قديم با صمغ تازه به مدت 72 ساعت پالايش مي شوند. قسمت هاي نيمه نازك (2) براي ميكروسكوپ چشمي و قسمت هاي فوق نازك (nm1/0) براي TEM توسط يك فراميكروتوم (فراريزبر) با تيغه الماس بريده مي شوند. لكه هاي بررسي شده براي آزمايش نور شامل هماتوكسيلين و ائوسين، قرمز اليزارين (روناس)، سه رنگ طبيعي (تري كروم) ميسون و آبي تلوئيدين مي شود. به غير از لكه آبي تلوئيدين، بخش هاي ديگر بايد با غوطه ور شدن به مدت 2 دقيقه در اتوكسيد سديم وهيدراته شدن از طريق محلول هاي درجه بندي شده اتانول پلاستيكه شوند.

تجمع تحريك آميز سلول را در اسفنج هاي برون كاشتني PHEMA را مي توان توسط تمركز ايمني شيميايي ياخته هاي ماكروفاژ با استفاده از به كارگيري پادتن ها بر ماكروفاژهاي بخش هاي منجمد شده و پارافيني بافت تثبيت شده در 2% پارافرم آلدئيد شناسائي كرد. نوتروفيلها را مي توان با اعمال ‎آنزيم شيمي بافت بر بخش هاي منجمد تثبيت شده در سيتوات – استون فرم آلدئيد نگهداري شده در كلرواستات AS-D نفتال در PH 3/6 به مدت 15 دقيقه در تاريكي و دماي C⁰ 37 شناسائي كرده و توسط هماتوكسيلين با لكه ها مقابله كرد. عبارت ماهيچه صاف  اكتين به عنوان علامت شيميايي تبديل مايوفيبربلاست به كار رفته و توسط روش هاي متمركز سازي ايمني ياخته شيميايي در كشت سلولي قابل شناسائي است.

محصول ماتريس برون سلولي در برون كاشتني ها PHEMA توسط اتوراديو گرافي شناسائي مي شوند. كلاژن توليد شده توسط سلول ها ونوع آن را مي توان با استفاده از پرولين H ]3 –3 و 2[- (مقدماتي) و تمركز ايمني ياخته شيميايي انواع كلاژن I- VI با پادتن هاي انساني و كلاژن گاوي شناسائي كرد. اين موضوع نشان مي دهد كه اسفنج هاي PHEMA هم نفوذ و هم ته نشيني سلول را ميسر ساخته و يك داربست بافت سه بعدي پايدار و اشكل مي دهد.

چگالي و زيست پذيري سلول را ميتوان با استفاده از تصحيح روش لك اندازي فلورسانت كه توسط پول و همكارانش صورت گرفت انجام داد. اين روش بسيار حساس و قابل اطمينان از دو نوع رنگ فلورسانت استفاده مي‌كند: 5-كلرومتيل فلورسئين دي استيت (CMFDA) و اتيديم و هموديمر (هم پار) 1 كه به ترتيب جهت شناسايي سلول هاي زنده و مرده مورد استفاده قرار مي گيرد. نمونه هاي بافتي برون كاشته شده با اهداف متفاوت همراه با CMFDA و يا با اتيديم هموديمر 1 به مدت 24 ساعت در C⁰ 37 نگهداري مي شوند. بعد از آن گونه ها به طور مختصر در 2% پارافرمالدهايد تثبيت شده و در دماي بهينه برش محيط پيرامون منجمد (OCT) مي شوند. بخش هاي منجمد شده را مي توان بر روي اسلايدهاي پوشيده شده با آمينو پروپيل تري تكسي سيلان جمع آوري كرده و در ميكروسوپ فلورسانت مشاهده نمود و بدين ترتيب تحليل نيمه كمي از سلول هاي زنده و مرده به عمل آورد.

-اشارات و فوت و فن هاTIPS AND KNOW – HOW                                     

نرخ منومر در آب تنها فاكتور مهم در كنترل مورفولوژي نهايي است . متغيرهاي ديگري كه مي توانند بر مورفولوژي نهايي تأثير بگذارند شامل دماي زمان بسپارش، مقدار اكسيژن حل شده در تركيب منومر و غلظت و نوع مواد شيمايي در تركيب منومر است.

تثبيت اين پارامترها در زمان بررسي اثر تغيير يكي از آنها بسيار مهم است.

HEMA بايد يك سيال صاف بوده و اگر هر گونه زردي در آن مشاهده شود بايد منومر خارج گردد. HEMA معمولاً قبل از استفاده تحت خلاء تقطير مي شود و در صورتي كه باز دارنده ها (ممانعت كننده ها) و هيدروكوئينين مونومتيل اتر (MEHQ) را از آن خارج كنيم زمان ذخيره سازي (نگهداري) آن كوتاه مي شود. اگر HEMA با خلوص بالا حاوي كمتر از ppm50 ، MEHQ خريداري شود و بطري آن به طور مرتب تعويض شودHEMA  را مي توان بسادگي پس از دريافت استفاده كرد. بهتر است كه منبع ويژه HEMA را انتخاب كرده و مقادير كمي از آن به عنوان توزيع كننده، نگهداري شود و هر 6 ماه يك بار يك بطري جديد سفارش داده شود.

معمولاً مقداري اتيلن دي متا اكريليت ‍(EDMA) در HEMA خريداري شده وجود دارد كه براي بررسي حساسيت با تخريب پذيري مي توان EDMA را به وسيله استخراج در هگزان خارج كرد. براي استفاده عمومي، نيازي به خارج سازي EDMA از HEMA نبوده و براي ايجاد همخواني (سازگاري) بين دسته ها توصيه مي شود كه HEMA را توسط غلظت مشخصي از EDMA خنثي كرد. اين كار از واكنش كنتيك متغيرها جلوگيري كرده و خطاهاي ناشي از رهايش مقادير كم EDMA به تركيب منومر را برطرف مي‌كند. عامل شبكه ساز با اثر گذاري بر كنتيك هاي واكنش مصرف HEMA و همچنين كنتيك هاي تفكيك فاز در برابر ژل شدگي نقش پيچيده اي را در آرايش داربست بازي مي‌كند. برخلاف ژل هاي PHEMA ارتباط زيادي بين غلظت عامل شبكه ساز و استحكام داربست هاي PHEMA وجود ندارد غلظت معمول به كار رفته EDMA براي داربست ها در حدود  %wt25/0 –1/0 است.

محلول تازه پرسولفات آمونيوم (APS) بايد براي هر فرمولاسيون تهيه شده و ساده ترين روش براي اين فرايند تكراري سنجش دقيق g(*) 1/0 و پوشاندن ظرف با آب تا g(*)1 است. وزن ظرف بايد در تعادل وزني بين APS اضافي و آب محاسبه شود. اسفنج هاي PHEMA ساخته شده با غلظت هاي كم APS معمولاً ضعيف و چسبنده هستند. در صورتي كه تمايل به واكنش آرام داشته باشيم به جاي بازدارنده مي توانيم از عامل شتاب دهنده با غلظت ضعيف تر استفاده كنيم.به طور كلي غلظت APS بايد بيشتر از wt%3/0 غلطت منومر باشد. براي غلظت هاي پائين تر منومر ممكن است نياز به غلظت بالاتر باشد. براي مثال براي يك تركيب 10:90، HEMA و آب، غلظت wt%5/0 توصيه مي شود. TEMED به محض دريافت با توزيع در تركيب منومر توسط ميكروپيپت استفاده مي شود. TEMED يك اهدا كننده الكترون بسيار قدرتمند تر از ديگر عامل هاي شتاب دهنده (تسريع كننده) مانند متابي سولفات سديم (SMBS) و اسيد اسكوربيك بوده و در نتيجه نرخ واكنش آن بسيار سريع تر است. هنگامي كه عامل شتاب دهنده SMBS باشد لايه لايه شدگي و استقرار ورفولوژي مشاهده مي شود.

براي خارج كردن اكسيژن حل شده مي توان گاز نيتروژن يا هليوم را براي مدت زمان مشخصي (~15 دقيقه) به شكل حباب در تركيب منومر وا رد كرده و يا اينكه ميتوان منو ر را به صورت عرضه شده (تحت پردازش قرار نگرفته) مصرف كرد. اسفنج PHEMAرا كه با گاز خنثي حباب دار شده اند را با آنهايي كه نشده اند مقايسه نكنيد. خروج اكسيژن حل شده بر نرخ واكنش و در نتيجه مورفولوژي تأثير مي گذارد. در صورت استفاده از منومر عرضه شده انسجام (هم خواني) هر تركيب ضروري است.

-نتايج و خط مشي آيندهCONCLUSIONS AND FUTURE DIRECTIONS   تهيه داربست نفوذ پذير سلولي PHEMA ساخته شده توسط بسپارش HEMA در آب اضافي و اتوكلاوكردن آنها راحت بوده و گران نمي باشد. علاوه بر اين طرح شيمي ارائه شده در اين فصل اجازه ساخت مكرر داربست هاي PHEMA را مي دهد. داربست هاي PHEMA در آب فرسوده نشده و توليد محصولات تخريبي نمي كند و حد فاصل سلول- سطح داربست پايدار است. اصلاح سطح مانند افزودن پپتيد يا مولكول هاي زيست فعال تترينگ به اين دار بست مصنوعي امكان پذير بوده و از عملكرد هيدروكسيل بهره مي برد.

اسفنج هاي PHEMA را ميتوان با مقادير بسيار كم عامل شبكه ساز (wt%05/0~) ساخته و هر گونه ناخالصي EDMA قابل حذف كردن است. در صورتي كه داربست هاي PHEMA جهت تخريب اصلاح شوند، آزمايشات ارزيابي تورم كاشتني و محصولات سمي و تخريب پذير لازم خواهد بود.

تشكيل داربست توسط بسپارش نسبت به روش هاي ديگر تهيه داربست داراي مزايايي است. داربست در حين بسپارش از نواحي عاري از پليمر و غني از پليمر تشكيل شده و بدين ترتيب شكل و مورفولوژي را مي توان بالقوه توسط تحريكات خارجي از قبيل نيروهاي سانتريفوژ يا نور تغيير داد. چنين كنترلي بر شكل داربست، مي تواند منجر به چندگاني مورفولوژي ها و هندسه آنها شده كه براي كاربردهاي مهندسي بافت مطلوب است.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

-قوانين درون مركزي و بازنگري درمان هاي مهندسي بافت

اغلب اوقات، در درمان هاي مهندسي بافت سلولهاي همراه با پليمر، سلول هاي دگرزا يا مشتقات بافت در خلال فرايند ساخت با هم تركيب شده و قبل يا بعد از فرا كاشت به آنها دارو اضافه مي گردد. اين سطح پيچيدگي سبب شده است كه FDA همكاريش را با CDRH ، CBER و CDER در بازنگري درمان هاي مهندسي بافت به شكل رسمي توسعه دهد. اين همكاريها با شكل گيري گروه متمركز باليني درمان جراحات و مشاوره صنعتي : جراحات سوختگي و زخم هاي مزمن پوستي – محصولات جديد درماني به صورت رسمي درآمد. همچنين پيچيدگي كاشتني هاي مهندسي بافت گاها لزوم بازنگري درمان توسط مراكز مختلف FDA را واجب مي دارد. در اين موارد، مسئوليت اصلي بازنگري را يك مركز با مشاوره ديگر مراكز در صورت نياز بر عهده مي گيرد. گفتگوي اوليه با FDA قبل از ارائه يك درخواست جهت مطالعه درمان تحقيقاتي مي تواند به ارسال مستقيم درخواست به مراكز مربوطه كمك كند.

از نظر تاريخي، سياست هاي جدا و متمايز FDA سبب درك اهميت استاندارد شده است. درسال 1997، همكاري FDA و موسسه ملي استاندارد و تكنولوژي (NIST) سرآغاز فرآيند توسعه استانداردهاي براي محصولات پزشكي مهندسي بافت (TEMPs) بود. بعد از برگذاري چندين جلسه، توسط اساتيد دانشگاه و صاحبان صنايع تصميم گرفته شد كه روند توسعه استاندارد تحت نظارت دولت قرار نگيرد (FDA, NIST) بلكه بصورت يك جريان عمومي با حمايت مالي دولت باشد. تصميم ديگري كه مورد توافق اكثريت قرار گرفت توسعه استاندارد هاي TEMPs توسط انجمن سنجش و مواد آمريكا (ASTM) بود. اين مقدمات پايه گذار بخش مجزاي كميته FDA براي تجهيزات پزشكي ASTM شد. از سال 1997، پيشرفت هاي قابل ملاحظه اي در استقرار استانداردهاي TEMPs صورت گرفته است.

-استاندارد سازي توسط   STANDARDIZATION THROUGH THE ASTM

ASTM خود را بصورت ذيل معرفي مي كند.

ASTM بعد از تاسيس در سال 1898، به يكي از بزرگ ترين كانديدهاي سيستم هاي توسعه مند استاندارد در جهان تبديل شد. ASTM يك سازمان غير انتفاعي است كه تبادل نظر توليد كنندگان، كاربران مصرف كنندگان نهايي و علاقه مندان (دولت و اساتيد دانشگاه) را فراهم آورده و با برگذاري جلسات در موضوعات مختلف مبادرت به نوشتن استانداردها براي مواد، محصولات، سيستم ها و سرويس ها مي كند. ASTM با داشتن 130 كميته نويسنده استاندارد هر سال بيشتر از 10700 استاندارد را منتشر مي كند. اين استانداردها و ديگر اطلاعات فني مربوط در سرتاسر جهان بكار برده مي شوند.

از نظر تاريخي، كميته FO4 مسئوليت توسعه استانداردهاي تجهيزات پزشكي را بر عهده گرفته است. نمونه هاي ذيل چندين موضوع از هزاران عنوان مطرح شده در FO4 هستند كه تنها به اين موارد محدود نمي شوند: 1- خصوصيات فلزهاي بكار رفته در كاشتني هاي جرامي 2- روش هاي آزمون خمش استاتيك صفحات فلزي استخوان 3- خصوصيات سيمان اكريليك استخوان 4- روش هاي تحليل فلزات بازيافتي كاشتني هاي شكسته بندي 5-ضوابط مربوط به پلاستيك هاي اپوكسي گرما سخت قابل كاشت 6- طبقه بندي الاستومرهاي سيليكوني بكار رفته در كاربردهاي پزشكي و 7-واژه نامه تخصصي مربوط به بيومواد پليمري بكار رفته در تجهيزات جراحي و پزشكي. بر اساس تجربيات گسترده تجهيزات پزشكي و با توجه به پليمرهاي تخريب پذير خاص (براي مثال، پلي لاكتيك اسيد) تحت مطالعه PO4 كه بصورت كاشتني مهندسي بافت قابل استفاده هستند، روند توسعه استانداردها براي TEMPS تحت مديريت كميته تجهيزات پزشكي قرار گرفت. از آنجا كه حركت ASTM غير انتفاعي بوده و FDA يا هر سازنده ديگر را در استانداردهاي خود مرتبط نمي سازد اما، بايد توجه داشت كه FDA در روند ارزيابي درمان هاي تحقيقاتي خود به طور مكرر به استانداردهاي ASTM رجوع مي كند. اطمينان FDA از آنجا ناشي مي‌شود كه توسعه استانداردها توسط ASTM بصورت اتفاق نظر همگاني بين اساتيد دانشگاه. صاحبان صنايع و دولت است. شركت مستقيم FDA در روند ASTM حاكي از اهميت اتفاق نظر در استانداردهاي TEMPS است. انتظار مي رود كه سرمايه گذاري شركت كنندگان علاقمند منجر به آماده شدن تعداد زيادي از درمان هاي جديد در زمان كوتاه و هزينه كم شود. بنابر اين مهندسان بافت كه قصد دارند از تكنولوژي هاي باليني جديد استفاده كنند از شركت كردن در جلسات ASTM در مورد TEMPs و آگاه شدن از آن سود خواهند برد.

-ساختار سازماني بخش III كميته PO4 رباي

گفتگو در مورد مراحل ابتدايي بخش IV ، FO4 منجر به شناسايي دو مبحث بزرگ در توسعه استانداردها مي‌شود. تركيبات و عملكرد. همچنين مشاهده مي‌شود كه اين استانداردها جهت تاييد بايد با مواد مرجع مناسب مقايسه شوند. براي بررسي اين موضوعات پيچيده ده زير كميته (شكل 1-1) مستقر شدند. اين زير كميته ها به سه گروه سازماندهي مي شوند: طراحي اجزاء، ارزيابي و شرايط معمولي TEMPs. زير مجموعه طراحي اجزاء زير كميته هايي براي بيو مواد مهندسي بافت سلول ها، بيومولكول ها و سيستم هاي رهايش هستند. زير مجموعه ارزيابي را زير كميته هاي ارزيابي (به عبارت ديگر پيش باليني) و آزمون هاي باليني تشكيل مي دهند. شرايط معمولي كليه TEMPS شامل زير كميته هاي عملكرد بيولوژيكي طبيعي، تشريح بافت، واژه نامه و ايمني ميكروبي و عامل غير موروئي است. علاوه براين، 41 گروه كاري تحت اين زير كميته ها فعاليت مي كنند كه مسئول توسعه استانداردهاي موجود در حيطه مربوطه هستند. در طول فرآيند سازماني مشاهده شد كه سه زير كميته (بيومواد مهندسي بافت، عملكرد بيولوژيكي طبيعي و ارزيابي) استانداردها را در گروههاي اجرايي براي يك سيستم بافت يا اندام مشابه توسعه مي دهند. با پذيرش اين موضوع كه تقريباً هر بافت يا اندام در بدن انسان قابل مهندسي كردن است، گروههاي اجرايي در زمينه بافت با هم يكي شده و 10 موضوع ذيل را پوشش مي دهند: قلبي عروقي، گوارشي، غدد درون ريز، خون سازي، پوشش بدن، ماهيچه اسكلتي، حسي عصبي، تنفسي، توليد مثل و ادراري. اين ساختار سازماني بخش IV كميته FO4، ASTM يك چهار چوب جامع براي توسعه استانداردهاي TEMPS فراهم مي كند.

-روند توسعه استانداردها     PROCESS FOR STANDARDS DEVELOPMENT

اگر چه مهندسي بافت بصورت يك رشته تحصيلي نوظهور شناخته مي‌شود اما روند توسعه استاندارد ASTM بخوبي پايه گذاري شده است.زير كميته ها مسئول تعريف حوزه فعاليت خود كه شامل توسعه استانداردها درون حيطه موضوعي شان است مي باشند.

 

هيچنين گروههاي اجرايي موظف به تهيه پيش نويس استانداردهاي مربوط به عناوين ويژه حيطه موضوعي شان هستند. معمولاً اين عناوين ويژه شامل واژه نامه، مواد و روش هاي تحليل تجهيزات پزشكي، يا اجزاء دستگاههايي را كه براي بازاريابي تاييد شده و يا تحت بررسي هستند، مي‌شود.

پيش نويس هاي استانداردهاي TEMPs مي توانند شامل طبقه بندي سطوح خطر TEMPs مطابق الگوريتمي كه بر اساس اجزاء محصول، محل فعاليت، هدف درماني، مدهاي اصلي عمل براي دستيابي به اثر درماني، مدت زمان درمان و عمر TEMP، به هر TEMP يك عنوان عددي – حرفي را نسبت مي دهد باشد. پيش نويس استانداردها براي بازنگري ازگروه اجرايي به زير كميته ارائه شده و متعاقباً براي راي گيري اعضاء به كميته اجرايي بخش IV ارجاع مي‌شود. در طول مدت راي گيري، اعضا فرصت اظهار نظر دارند. كليه نظرات اعضاي ASTM لحاظ شده و با موافقت اكثريت مورد بررسي قرار مي گيرد. سپس استاندارد براي پذيرش راي گيري مي‌شود. بعد از اينكه استانداردها توسط گروههاي اجرايي خاص بسط داده شده و مورد پذيرش قرار گرفت، گروههاي اجرايي منحل مي شوند تا زماني كه بازنگري دوباره استاندارد مورد نياز باشد زير كميته ها تا زماني كه بخش يا كميته تشخيص دهد باقي مي مانند.

جزئيات جريان ASTM براي توسعه استانداردها در وب سايت اينترنتي ذيل موجود است، (http://www.astm.org)

 

- رابطه با FDA                                                             RELATIONSHIP WITH FDA

همانطور كه قبلاً اشاره شد، اهميت استانداردهاي ASTM براي FDA با شركت مستقيم نماينده فدرال در سازمان مجمع فني و جريان امور مورد تاكيد قرار مي گيرد. درك و احاطه استانداردهاي ASTM مورد قبول FDA براي تعيين ايمني و اثر گذاري، احتمال مراجعه FDA به استانداردهاي ASTMرا در ارزيابي درمان هاي تحقيقاتي افزايش مي دهد. البته، در زمان نبود استانداردهاي واقعي براي مهندسي بافت، اهميت استانداردهاي ASTM افزايش مي يابد زيرا FDA اساساً يك سازمان استاندارد نيست. اگر چه FDA توسط استانداردهاي ASTM محاصره نشده است اما توسعه اين اسناد با روند همگاني فعلي ممكن است FDA را از حالت استقلال خارج كرده تا استانداردهاي مورد تاييد در مجمع را توسعه دهد. تا زماني كه ASTM موضوعات مورد توجه FDA را مورد ملاحظه قرار مي دهد، كل روال ASTM شرايط FDA را بر آورده مي سازد. شركت FDA در ASTM مي تواند بيشترين اثرات قانونمند را بر ASTM داشته باشد. از طرف ديگر هوشياري ديگر رقيبان شركت كننده در ASTM از منحرف شدن مسير توسعه استانداردها توسط FDA جلوگيري مي كند. با در نظر گرفتن اهداف متقابل در مهندسي بافت و همكاري در جهت نيل به اين اهداف، ASTM و FDA در حال بوجود آوردن يك ارتباط سازنده هستند كه در آينده منجر به شكل گيري بيشترين تعداد درمان هاي پيشرفته مهندسي بافت در جهت فراهم سازي بزرگ ترين منفعت پزشكي يعني كم كردن خطر براي بيماران مي‌شود.

-هماهنگي بين المللي             INTERNATIONAL HARMONIZATION

بحث فعلي موضوعات قانون مند مربوط به مهندسي بافت در ايالت متحده درامور ملاحظه قرار داده است. در صورتيكه، مهندسي بافت يك زمينه پژوهشي جهاني است كه بايد اصول ايمني و تاثيرپذيري را بدون توجه به مكان در نظر بگيرد. تقريباً اكثر مواردي كه تاكنون شرح داده شد (وضعيت مساعد اهدا كننده، انتقال بيماري، تعيين خطر) توسط سازمان بين المللي استانداردها (ISO) مورد توجه قرار گرفته است. بنابر اين براي ارتقاء سطح دسترسي بين المللي درمان هاي جديد، استانداردهاي توسعه يافته در ايالت متحده بايد با استانداردهاي متداول ISO هم خواني داشته و بر عكس(45، 34، 29) البته بايد توجه داشت كه استانداردهاي ISO و US بخاطر فاكتورهاي اقليمي بطور مثال مشاهده بيماري جنون گاوي (BSE) در اروپا كه در ايالت متحده ديده نشده است داراي تفاوت هايي نيز هستند. با اين همه، هماهنگي بين المللي استانداردها سبب پيشرفت مهندسي به عنوان يك زمينه پژوهشي و صنعتي درجهان مي‌شود.

-مسئوليت‏ها، آئين‏ها و چشمداشت ها در آينده

FUTURE PROSPECTS, ETHICS, AND RESPONSIBILITY

با وجود اينكه، اكثر تازه وارداني كه با كاربردهاي درماني مهندسي بافت آشنا مي شوند بطور مطلوب تحت تاثير قرار مي‏گيرند اما بافت هاي مهندسي عموما در مقايسه با بافت‏هاي سالم مربوطه از نظر آناتومي و فيزيولوژي به صورت ناقص باقي مي مانند. علاوه بر اين ساخت اندام هاي كاملاً عملياتي هنوز بصورت يك آرزوي تحقق نيافته باقي مانده است. با اين حال، اصول صحيح بافت سازي و اندام سازي براي محققان آينده پايه ريزي شده است. همچنين توان فوق العاده مهندسي بافت امكان تصحيح آگاهانه بافت ها به منظور توسعه عملكرد بيولوژيكي را فراهم ساخته است. علارغم اين پتانسيل خود جوش مهندسي بافت، افزايش عملكرد طبيعي همچنين سبب بالا رفتن وحشت از ايجاد نژاد انساني ديگر مي‌شود.با وجود اينكه بافت هاي نظير اين بر طبق اصول و مقررات و باورهاي اخلاقي تحت بررسي قرار مي گيرند اما كنگره ايالت متحده در حال بازنگري قوانيني است كه تعيين مي كنند آيا بودجه فدرال ايالت متحده صرف تحقيق بر روي بافت هاي جنيني يا سلول هاي ساقه جنين براي فرا كاشت در بشر ميشود يا نه. اگر قوانين فراكاشت بافت تصويب شوند لزوم اجراي آنها به يكي از مسئوليت هاي FDA تبديل خواهد شد. در چنين مباحثي، نقش FDA فراتر از اصول ايمني و تاثير گذاري خواهد بود. در نتيجه اين وظيفه طرفداران مهندسي بافت است كه از محيط قانون مندي كه در آن كار مي كنند آگاه بوده و در مقدمه معرفي تعهدات مهندسي بافت شركت كنند. براي درك بيشترين تعداد بهره هاي پزشكي مهندسي بافت، بايد روال كشف دانش ساخت كاشتني ها در آزمايشگاه با شركت در روال تنظيم سازي و پايه ريزي استانداردها جهت تسهيل ارزيابي تركيبات و اجرا همراه شود.

ساروين كارميول

اين فصل دو مقوله: گزينش (Selection) و جداسازي(Isolation) سلول را در بر ميگيرد. تقسيم بندي فوق از نظر اولويت صورت گرفته است. براي كسب بهينه ترين نتيجه، بهتر است كه ايزولاسيون و گزينش به طور همزمان صورت گيرد. بغير از سلول‏هاي سيستم خون سازي و بافت‏هاي جنيني خاص سلول‏هاي معمولي ديگر ذاتاً به ماتريس‏هاي خارج سلولي مرتبط مي شوند. شيوه‏هاي متفاوت پاره كردن (گسيختن) ماتريس‏ها نه تنها بر كارائي گوراش آنزيمي بلكه بر جمعيت سلولي تأثير مي گذارد. همچنين سيستم كشت سلولي كه شامل ماده بازال (بنيادي) و مكمل‏ها است نه تنها با فراهم كردن مواد غذايي و شرايط مناسب بر بقاي سول‏ها تأثير مي گذارد بلكه مي تواند يك پتانسيل گزينشي قابل ملاحظه را در ترجيح يك نوع سلول بر ديگري اعمال كند.

نوشته‏هاي فراواني درمورد موضوعات اين فصل وجود دارد. ايزولاسيون و پاك سازي سلول‏ها يك فرايند پيچيده است و يكي از اهداف اين فصل كمك به آسان نمودن اين پيچيدگي است. براي كسب اطلاعات مفصل در مورد جنبه‏هاي گوناگون كشت سلولي لطفاً به نوشته‏هاي فرشني اشتودزينسكي و مسترز مراجعه كنيد.

- ايزولاسيون سلول                                                    CELL ISOLATION   

تحقيقات به خوبي نشان مي دهد كه انواع سلول‏هاي مشابه مانند سلول‏هاي فيبروبلاست، اندوتليال يا پري اديپوسايت‏ها در محل‏هاي آناتومي مختلف داراي مشخصه‏هاي متفاوت هستند. اما اين موضوع كه چگونه سلولهاي آناتومي يك محل نيز مشخصه‏هاي متفاوت از خود نشان مي دهند هنوز به خوبي شناخته شده نيست. ناهمگني سلولي (هيتروژنيتي) در اثر خصوصيات ويژه آنها رخ مي دهد. اين خصوصيات مي تواند يكي از پارامترهاي عملياتي جمعيت سلولي باشد. پديده فوق با اين تصور كه خصيصه‏ها لزوماً در داخل جمعيت سلولي داراي توزيع همگن (هموژن) نيستند قابل توجيه است. فيبروبلاست‏ها جمعيتي هستند كه در داخل محل آناتومي از خود خصوصيات فنوتيپيكي متفاوت نشان مي دهند، مطالعات فرايز و همكارانش همچنين لكيك و همكارانش را بر روي موش، ريه انسان، لثه (پيرادنداني) و هتروژنيتي (ناهمگن) فيبروبلاست لثوي ملاحظه كنيد. همچنين مشاهده شده است كه فيبروبلاست‏ها عكس العمل‏هاي متفاوتي به تحريكات كلاژن‏هاي آزاد شده توسط تومور يا سلول‏هاي قليا خواه (mast cells) نشان مي دهند. علاوه بر اين فنوتيپ‏هاي مختلف سلول‏هاي اندوتليال عروق كوچك در كورپوس لوتئوم (جسم زرد گاو) (luteum bovine corpus) با در نظر گرفتن اكتين، سايتوكراتين و ويمنتين حساس به گاما، اينترفرون (IFN- ) نشان دهنده هتروژينتي است. منطقي است اگر كل جمعيت سلولها را با توجه به خصيصه‏هايشان در هتروژنيتي (ناهمگن) دخيل بدانيم. هدف سنتي از انجام كشت سلول‏هاي اوليه تهيه مقدار كافي از سلول‏هاي قابل رشد واجد شرايط مي باشد كه تضمين كننده شباهت توزيع نهايي سلول‏ها با توزيع يافته شده در بافت اصلي است. استفاده از كشت سلولي به عنوان مدلي براي شرايط داخلي بدني (in vivo) تا حد.ود زيادي به الزامات زير نيازمند است. چندين فاكتور مؤثر بر نتيجه عبارتند از: محل آناتومي، پاتولوژي (آسيب شناسي)، نرمالسي (normalsy) يا درجه ايسكمي (كم خوني) ميزان فراواني بافت به كار رفته بر اين فاكتور‏ها تأثير مي گذارد. طبيعت متنوع معماري بافت به روش‏هاي مختلفي براي توزيع سلول نيازمند است. براي مثال استخوان، مغز، ماهيچه‏هاي اسكلتي كبد و طحال داراي پيوندهاي ماتريس سلول- سلول و سلول- برون سلولي هستند. نتيجه اين شرايط اين است كه هيچ قراردادي همه انواع بافت را پوشش نمي دهد. در مورد نحوه ايجاد كشت اوليه و تجزيه بافت مطالب چندي منتشر شده است كه تلاش در بهينه سازي اين موضوعات براي سلول نتيجه بخش خواهد بود.

-توضيح

استراتژي‏هاي مختلفي براي ايزولاسيون سلول‏هاي موجود در بافت‏هاي سخت وجود دارد از جمله: روشهاي برون كاشت (explantation) آنزيمي، مكانيكي و تجزيه شيميايي، (chemical disaggregation) تزريقي (perfusion) يا تركيبي از آنها. يكي از جديد ترين شيوه‏ها در جداسازي سلول و تكثير سلول‏ها در داخل آزمايشگاه (in vitro) برون كاشت قطعه‏هاي بافت است. در اين روش تا زماني كه انتشار مواد غذايي و گازها محدود نشود بافت به قطعات بسيار كوچك خرد ميشود. اين عمل با بريدن و كوچك سازي بافت مورد نظر تا اندازه اي مناسب صورت مي گيرد. سپس قطعات باف در ظروف كشت بافت كه با سرم جنيني گاو (fetal bovine serum) يا ماتريس‏هاي ديگر پوشيده شده است قرار داده مي شود. تركيب ماده و پوشش سطح همان طور كه در ايزولاسيون انواع سلول از گلومرول‏ها (glomerulus) نشان داده شده است، مي تواند اثر قابل توجهي بر نوع سلول نهايي توليد شده داشته باشد. همچنين مي توان قطعات بافت را براي تثبيت اتصال در زير پوشش قرار داد زيرا تماس مستقيم با سطح كشت بافت براي كشت موفق برون كاشتني (explant) ضروري است.

عموماً براي قرار دادن بافت در محيط كشت از دستگاههاي مكانيكي استفاده شده و هيچ گونه آنزيمي اضافه نمي گردد. كشت اوليه توسط روش برون كاشت نسبت به ديگر روشها زمان بيشتري را طلب مي‌كند، اما روش برون كاشت به خاطر استفاده از خاصيت حساسيت پتانسيلي سلول مورد نظر به تركيب آنزيم داراي مزاياي بيشتري است. اگر آنزيم قابل ارائه در محيط باشد مي توان بافت را با غلظت آنزيمي بهينه براي مدت كوتاهي در دماي اتاق و يا براي مدت طولاني تري در دماي c⁰ 4 نگهداري كرد. در اينجا هدف، تجزيه بافت نيست بلكه سازگار كردن مناسب ماتريس برون سلولي جهت حركت مؤثر سلول مورد نظر است.

دليل انتخاب روش برون كاشت، حفظ سطح غشاء عملياتي است. همچنين در مواردي كه نمونه بافت موجود كوچك باشد روش جداسازي آنزيمي با مكانيكي بسيار مخرب بوده و سلول‏هاي فراواني از دست مي روند كه ادامه كار را غير ممكن مي سازد. تأثير آنزيم‏هاي پروتئوليتيك بر اجزا سطح سلول شناخته شده است، به طور مثال، ايموگلوبولين سطح (Ig) در اثر پروناز و كيموتريپسين به سرعت از لنفوسيت‏هاي B جدا شده ولي در اثر تريپسين و پاپائين اين عمل كندتر انجام مي شود و توسط كولاژن‏ها اصلاً صورت نمي گيرد. همچنين تريپسين در مقايسه با كلاژن فسفوليپيدها و اسيدهاي چرب راديواكتيو بيشتري را از غشاء اندوتليال سلول آزاد مي‌كند.

كشت اوليه برون كاشتي به قابليت حركت نوع سلول مورد نظر بستگي دارد از معايب اين روش بالاتر بودن پتانسيل رشد انواع سلول آلاينده نسبت به سلول مورد نظر و مشكل پيوستگي قطعات بافت است. از طرف ديگر اگر سلول مورد نظر پر تحرك ترين سلول باشد اين روش مي تواند تكنيك منتخب باشد.

يكي ديگر از موارد مورد توجه از بين رفتن مشخصه‏هاي فنوتيپيك سلول‏هاي به واسطه گوارش آنزيمي است. اگر سلول‏ها دقيقاً بعد از جداسازي مورد استفاده قرار گيرند، گوارش آنزيمي ضروري است. البته اگر هدف ايجاد يك جمعيت كشت سلولي آزمايشگاهي باشد شرايط اوليه سطح سلول از اهميت كمتري برخوردار خواهد بود. ساختارهاي غشائي با پارامتر تحمل وارونگي توصيف شده و براي يك جمعيت سالم سلولي مي توان فرض كرد كه ساختارهاي سطح قابل ترميم خواهند بود.

البته اين وضعيت براي هر نوع سلولي معتبر است.

- مكانيكي                                                                                                      MECHANICAL

روش‏هاي مكانيكي قطعه قطعه كردن بافت شامل روش گردابي، تكان دادن در شيكر چرخشي، پودر سازي با پيپت‏هايي با قطرهاي متفاوت، عبور بافت از ميان شبكه‏هاي نايلون و يا فولاد ضد زنگ و خرد كردن بافت با سوزن‏هاي نازك مي شود. اين فرايندها تعليق سلول را زودتر از گوارش آنزيمي ايجاد مي كنند، البته محدوديتهايي در اين مورد وجود دارد. اين روش‏ها به طور كلي براي همه بافتها مؤثر نيستند. تشخيص نوع روش بستگي به مقدار نيروي اعمال شده به بافت داشته كه اين جنبه مي تواند سبب آسيب شود. سلول‏ها به برش حساس بوده و آسيب جدي مي بينند. برش سلولهاي استوبلاست شكل MC3T3-E1 به دست آمده از جمجمه نوزاد موش سبب تغيير مورفولوژي ‍(شكل) و كاهش تدريجي كلسيم بين سلولي باقي مانده گرديد. همچنين رشد سلول‏هاي اندوتليال به واسطه تنش برشي تيغه اي متوقف شد. ادامه اين بحث در صفحات بعد آمده است. البته در مورد برخي از بافت‏هاي نرم از جمله طحال، تيموس، گره‏هاي لنفي كبد جنيني و تومورهاي نرم و احتمالاً مغز مي توان تجزيه مكانيكي را بدون آسيب سلولي اجرا كرد.

روش‏هاي مكانيكي در پاسخ به اثرات بالقوه زيان آور آنزيم‏ها درطول گوارش توسعه پيدا كردند. هنگامي كه شرايط ايزولاسيون مناسب براي وسايل مكانيكي مهيا باشد اين روش بر روش گوارش آنزيمي بخصوص بازسازي سلولي ارجعيت دارد. تحت اين شرايط كاهش معرف‏هايي مانند آنزيم‏ها وجود منابع، تأثيرات و هر گونه مطلب قانون مند ديگر را غير ضروري مي سازد. البته زماني كه روش‏هاي مكانيكي با گوارش آنزيم همراه شود مؤثر تر خواهد بود. لايه لايه كردن بافت با چاقوي جراحي براي كم كردن اندازه بافت و در نتيجه افزايش سطح منجر به ايزولاسيون مؤثر تر مي گردد.

-گوارش آنزيم                                                                             ENZYME DIGESTION

نوع آنزيم به كار رفته بر نتيجه گوارش تحت عناوين بازده، راندمان محصول، قابليت رشد و سميت تأثير مي گذارد. ايزولاسيون سلول‏ها از تومورهاي سخت با استفاده از تجزيه آنزيمي يا مكانيكي منجر به فراواني‏هاي متفاوت مي شود. در بافت ايزوله شده به روش آنزيمي، زير جمعيت آنوپوليد (aneuploid subpopulation) در مقايسه با بافت به دست آمده از تجزيه مكانيكي نمايان تر است. كه بيانگر آسيب پذيري متفاوت جمعيت‏هاي مختلف سلول‏هاي بافت در برابر تركيبات آنزيمي است. همچنين درمطالعات انجام شده بر فرايند جداسازي هپاتوسايت موش در هنگام استفاده از EDTA به جاي كولاژن محتويات سايتوكروم 450 P قابل شناسائي به روش طيفي و مدت دار و حفظ و نگهداري سيستم اكسيد از با كار كرد تركيبي به دست آمد. در مورد اين مشاهدات استثناهائي نيز وجود دارد: مطالعات نشان مي دهد كه سلول‏هاي توموري را مي توان با استفاده از گوارش آنزيم بسيار مؤثر تر از روش‏هاي مكانيكي جدا كرد . و اينكه كلاژن‏هاي ايزوله شده پيگ هپاتو سايت‏ها خيلي بيشتر از EDTA ايزوله شده هپاتوسايت‏ها زنده مي مانند. يك تفسير در مورد اين نتايج متنوع بر مبناي حساسيت نسبي سلول‏ها نسبت به آنزيم‏ها و تجزيه مكانيكي استوار است. تأثير بسياري از متغيرهاي غير قابل كنترل نيز (به طور مثال شرايط بافت) بر اين مشاهدات اضافه مي شود.

هپاتو سايت‏هاي ايزوله شده موش بالغ به وسيله تزريق تريپسين و كلاژن نشانگر خصوصيات متفاوت بود: هپاتو سايت‏هاي كلاژني داراي بازده چسبندگي دو برابر بوده و مدت طولاني تري در محيط كشت باقي مي ماندند، همچنين توليد آلبومين بيشتري داشته و فعاليت تيروسين آمينو ترانسفراز در آنها در مقايسه با هپاتو سايت‌هاي جدا شده توسط تريپسين بيشتر است. در جداسازي پروسين از جزاير لوزالمعده توسط گوارش با كلاژن، جزاير بزرگ به فعاليتهاي پائين تريپتيك و نتايج جداسازي ضعيف به فعاليت بالاي تريپتيك مرتبط مي شود. باز داشتن تريپسين توسط پفابلوك (Pefabloc) منجر به بهبود تكثير جداسازي در جزاير لوزالمعده مي شود. نكته جالب در مورد ايزولاسيون توسط گوراش با آنزيم خارجي نقشي است كه ترشح داخلي آنزيم‏هاي پروتئوليتيك به واسطه فرايند گوارش ايفا مي كند كه اين ترشح خاص بافت است. بافت‏هاي به دست آمده از اهدا كنندگان مختلف نسبت به گوارش آنزيم عكس العمل‏هاي متفاوتي نشان مي دهد. از ‎آن جا كه لوزالمعده محل سنتز تريپسين است بايد به جداسازي سلول‏هاي جزاير لوزالعمده توجه داشت تا امكان ايجاد فراگوارش وجود نداشته باشد.

امروزه مي دانيم كه تريپسين مي تواند به غشاء سطح آسيب وارد كند، اما ظاهراً نقش ذاتي تريپسين نيز در اين مورد دخالت دارد. مطالعه دمايي تريپسين در طول يك مسير متوالي نشان داد كه دماهاي زير c⁰ 15 زيست پذيري (viability) و تكثير را افزايش مي دهد اين وضعيت با تأثير دما بر پديده‏هاي ذاتي ديگر غشاء سازگاري مي دارد. اگر مشكل اصلي زيست پذيري باشد، استفاده از دماي پائين تر در طول گوارش پيشنهاد مي شود.

براي گوارش بافت، اغلب كلاژنهاي تجاري به دست آمده از كلستريديوم هيستوليتيكم مورد استفاده قرار مي گيرند. تغييرات درجه ناخالصي بازدهي و سميت توصيف كننده تركيبات خام هستند تركيبات خام تعريف نشده هستند و از كلاژنازهاي مختلف، پروتئاز‏ها، فسفوليپازها و باكتريهاي همراه با محصول مانند اندوتاكسين تشكيل مي شوند. با توجه به نبود يك تعريف مشخص براي تركيبات كلاژن‏ها، وجود تفاوت‏هاي قابل ملاحظه بين محصولات فروشندگان مختلف و حتي يك فروشنده ثابت دور از ذهن نيست. تلاش براي تصفيه تركيبات كلاژناز خام توسط بازده گوارش بافت احيا شده توصيف شده و نشان دهنده حضور پروتئاز‏هاي تصفيه شده كه يك استراتژي مؤثر است، جهت تأئيد عدم وجود اثرات زيانبخش بايد دقت لازم به عمل آيد. استفاده از سيستم‏هاي آنزيمي مشخص با افزايش تعداد محصولات درمان سلولي اهميت بيشتري پيدا مي‌كند. سازمان‏هاي قانونمند براي نيل به اهداف خود نيازمند شرح كامل اجزاء معرف‏هاي به كار رفته در تركيبات محصولات هستند. وجود اجزاء نامشخص مانند تركيبات آنزيم سبب ايجاد رقابت شديد ميگردد.

-تروما                                                                                                                               TRAUMA

بافت‏هاي بيرون آورده شده دچار ايسكمي مي شوند. مدل‏هاي ايسكمي بازتزريقي (Ischemia-reperfusion models) توسط واكنش‏هاي انفجار گونه اكسيژن (ROS) توصيف مي شوند. البته در اثر توليد سوپر اكسيد و پراكسيداسيون ليپيد در نبود باز تزريق نيز امكان صدمه ديدن وجود دارد يك اظهار نظر ظاهراً درست بيان مي‌كند كه در طول ايسكمي ميزان  كافي براي حفظ محصول سوپر اكسيد وجود دارد. اين گفته به نظر صحيح مي رسد زيرا به كار گيري ديسموتاز سوپر اكسيد (SOD) سيگنال ROS را تضعيف مي‌كند. اگر SOD به عنوان ضد اكسيد كننده اضافه شود بايد كاتالاز نيز اضافه گردد زيرا محصول ديسموتاسيون سوپراكسيد پراكسيد هيدورژن است كه به تنهايي قابليت آسيب رساني دارد. همچنين راديكالهاي آزاد تحت شرايط هيپوكسي در سلول‏هاي ماهيچه اي نرم شريان ريوي موش نشان داده شدند.

به كار گيري ضد اكسيده كننده‏هايي مانند ويتامين E ، ان- استيل- ال- سايستاين يا دي فنيلين يدوئيم نشان دهنده كاهش سطوح ROS و مرگ سلوهاي بعدي است. همچنين بازدارنده‏هاي پروتئاز مانند  ماكروگلوبولين و ضد اكسيد كننده‏هاي ان- استيلن- ال سايستاين تعداد سلول‏هاي آزمايشگاهي ژرم (germ cells) نخستين خوك را افزايش مي دهد. طولاني شدن و قرار گيري در معرض ROS منجر به مرگ بافت يا اپوپتوزيس مي گردد. قرار گرفتن در معرض شدت بالا به مدت طولاني مي تواند به مكانيزم اپوپتوتيك آسيب وارد كرده و مستقيماً منجر به مرگ بافت شود. فاكتورهاي رشد مانند فاكتور سلول استم(ساقه) و فاكتور باز دارنده سرطان خون (لوسمي) مي تواند جلوي اپوپتوزيس را گرفته و سبب بقاي سلول ژرم نخستين جنين موش شود.

هنگامي كه سلول‏هاي چسبنده از هم باز مي شوند حالت اپوپتوزيس يا به اصطلاح آنويكيس را مي گيرند. ROS نيز با تأثير گالكتين-3 بر آپوپتوزيس در اين شكل گيري سهيم است . افزودن اسيد بانگكركيك كه يك بازدارنده انتقال نفوذپذيري ميتوكندري است به طور قابل ملاحظه اي آنويكسيس استئوكلاست‏ها را همانند حضور
z -VAD-FMK كه يك بازدارنده كاسپيس است كاهش مي دهد در ايزولاسيون سلول جزاير پانكراس تركيبات (محتويات) مرتبط با ماتريس خارج سلولي براي مدت طولاني تري در محيط كشت زنده باقي مانده و در آزمون ترشح انسولين بهتر عمل مي كنند همچنين سلول‏هاي جنيني پانكراس با ملاحظه و رعايت موارد آپوپتوتيك و تغذيه اي از مرگ ايمن بوده وان- استيل- ال- سايستاين از اپتوزيس در سلول‏هاي جرم انساني در محيط آزمايشگاه جلوگيري مي كنند. ايزوله كردن برخي از انواع سلول‏ها مشكل است. فاكتورهاي زيادي در موفق بودن ايزولاسيون سلول و استقرار بعدي سيستم كاشت سلول دخيل هستند. ملاحظه تروماي سلول در بهتر شدن نتيجه نهايي تفكيك سلولي كمك مي‌كند.

-سنجش زيست پذيري (بقاسنجي)      MEASUREMENT OF VIABILITY

تغيير پذيري ذاتي عكس العمل‏هاي بافت به وضعيت‏هاي گوناگون كشت سلولي نياز به وسيله اي براي ارزيابي زيست پذيري سلول‏هاي حاصل از اين شرايط را دارد. سنجش زيست پذيري در بهينه سازي روش‏هاي كشت اوليه نسبتاً راحت است. بهترين راه براي ارزيابي زيست پذيري سلول استفاده از روش‏هايي است كه اثر تروما را مورد ملاحظه قرار مي دهد. به طور كلي كاهش استحكام (يكپارچگي) غشاء سلول در آخرين مراحل تروما اتفاق مي افتد كه اين امر منجر به تخمين بيش از اندازه زيست پذيري سلو مي گردد. براي مثال شروع و پيشرفت اپوپتوسيس (opoptosis) بدون ايجاد اختلال در غشاء سلول رخ مي دهد. با وجود تركيب دوباره فسفوليپيد‏ها معمولاً فسفا تيديل سرين با ورقه داخلي غشاء دولايه پلاسما مرتبط شده و در طول اپوپتوسيس به قسمت بيروني منتقل مي شود. آرايش نهايي سلول كه آشكار شدن آن ممكن است مدت‏ها طول بكشد تا حد زيادي به وقايع زيان آوري كه عامل آغاز آپوپتوسيس است بستگي دارد. از طرف ديگر آسيب ممكن است چنان شديد باشد كه يكپارچگي سلول در چندين دقيقه لطمه ببيند، بنابراين ارزيابي يكپارچگي سلول مي تواند مفيد باشد.

آزمون‏هاي زيست پذيري مختلفي براي اندازه گيري يكپارچگي غشاء وجود دارد. يكي از متداولترين روش‏ها، ممانعت آبي تريپان نام دارد كه بر مبناي ويژگي ممانعت سلول‏هاي زنده و رنگي شدن آنها و نفوذپذيري سلول‏هاي غير زنده و رنگي شدن آنها استوار است. اين آزمون شامل نگهداري سوسپانسيون سلول براي مدت كوتاهي
(min 5<) است. دليل كوتاه بودن اين زمان آسيب ديدن سلول‏هاي زنده و جذب رنگ توسط آنهاست.

يك نمونه از سنجش مستقيم جذب رنگ توسط سلول‏هاي زنده در ذيل آمده است. سلول‏هاي زنده رنگ غير فلورسنت دي استيل فلورسئين را ميگيرند، سپس درون سلول استيل مويتيز آزاد شده و فلورسئين توليد مي گردد كه فلورسنت بوده و غشاء سلول نسبت به آن ناتراوا است. در طول موج‏هاي گسيلي با تحريك مناسب سلول‏هاي زنده، رنگ فلورسان سبز از خود ساطع مي‌كنند. اين خصوصيت را مي توان هم با محاسبه بصري توسط ميكروسكوپ فلورسان و هم توسط تفكيك سلولي اندازه گيري كرد. سرم مي تواند دي استيل فلورسئين را هيدروليز كند، بنابراين آزمون‏هاي به اصطلاح طولاني مدت در صورتي كه سرم جزئي از ماده باشد توصيه نمي شود. همچنين فلورسانس فلورسئين بستگي به PH داشته و نيازمند بافرهاي (تثبيت كننده‏هاي) غير بيوكربناتي است. اين عامل عمدتاً در آزمون بقا سنجي از دخول محيط كشت سلولي جلوگيري مي كنند مگر اينكه توسط بافرهاي موثر غير بيوكربناتي مانند HEPES يا بافرهاي آلي ديگر محافظت شوند.

حساسيت بهتر با تركيب يدپروپيديم و دي استيل فلورسئين به دست مي آيد. يديروپيديم نسبت به سلول‏هاي زنده ناتراوا و نسبت به سلولهاي غير زنده تراوا است. تحت اين شرايط سلول‏هاي زنده از خود نور سبز فلورسانت و سلول‏هاي غير زنده نور قرمز روشن (درخشان) ساطع مي كنند. در مقايسه با روش تريپسين آبي مشخص مي شود كه پايداري روش دي استيل فلورسئين- يدپروپيديم در حضور رنگ‏ها در مدت زمان طولاني بيشتر است. وضعيت انرژي سلول با توجه به غلظت نوكلئوتيد آدينيليت يكي از نشانه‏هاي مهم زيست پذيري به شمار مي رود. اين رابطه به دليل دخالت ميتوكندري در آغاز اپوپتوزيس منطقي است. يكي از پارامترهاي سطح انرژي سلول بار انرژي است اين شاخص توسط نسبت ذيل معين مي‌شود:

[ATP]+0.5[ADP]/[ATP]+ADP]+[AMP] مقدار اين نسبت براي سلول‏هاي طبيعي در حدود 9/0 بوده و شروع كاهش از اين مقدار نشانگر آغاز اتلاف زيست پذيري است. براي مثال اندوتليال كشت شده و سلول‏هاي P388D1 پس از تحمل تنش اكسيد كننده ‍(اكسيدانت) افت بار انرژي از 95/0 تا 66/0 را در دقيقه اول نشان مي دهند، در صورتي كه در روش تريپان آبي تا قبل از 30 دقيقه نخست پس از شروع تنش هيچ گونه تغييري مشاهده نمي شود.

-گزينش                                                                                                                           SELECTION

گزينش بر اساس خاصيت‏هاي منحصر به فردي كه يك سلول را از ديگري متمايز مي‌كند مانند چگالي اندازه، نشانه‏هاي اختصاصي (ماركر) گذر راههاي منحصر به فرد متابوليكي و احتياجات غذايي صورت مي پذيرد.

-چگالي و اندازه                                                                               DENSITY AND SIZE

در سانتريفوژ نرخ ته نشيني ذرات به نيروهاي اعمال شده چگالي و وسكوزيته مايع بستگي دارد. بنابراين با يك نيرو و ويسكوزيته معين نرخ ته نشيني متناسب با اندازه ذره و اختلاف بين چگالي ذره و چگالي مايع خواهد بود. در نتيجه نرخ ته نشيني در زمان صفر شدن اختلاف بين چگالي ذره و چگالي مايع به صفر نزديك مي شود. همچنين نرخ ته نشيني با افزايش نيروي سانتريفوژ افزايش يافته و در اثر بالا رفتن ويسكوزيته مايع كاهش مي يابد.

از آنجا كه چگالي و ويسكوزيته مايع اثر قابل ملاحظه اي بر نرخ ته نشين ذرات دارد مواد و محلول ‏هاي گرادياني گوناگوني بر اساس اين خواص توسعه پيدا كرده اند. مواد كنتراست تركيب شده با «يد» كه در ابتدا براي مطالعات باليني كنتراست اشعه x توسعه يافتند در ايزولاسيون سلولي نيز مفيد واقع شدند. سري‏هاي مختلفي از اين مواد كنتراست بر اساس ساختار يوني غير يوني، منومري يا ديمري وجود دارند. دامنه اين مواد از متريزوات تا متريزاميد گسترش يافته است. (كه اولي از گونه غير يوني است) و نيكودنز كه يك ماده با سميت كمتر بوده و و براي ايزولاسيون نوتروفيل‏ها، پلاكت‏ها، سلول‏هاي استليت (ستاره شكل) پري آسينار لوزالعمده يا سلول‏هاي كوپفر استفاده مي شود. فيكول كه يك پلي سوكرز مصنوعي است به طور گسترده در ايزولاسيون گونه‏هاي سلولي مگا كاريو سيتها هپاتوسيت‏ها، سلول‏هاي جزاير لوزالعمده، نوتروفيل‏ها و لنفوسيت‏ها به كار برده مي شود. تركيب دياتريزوات سديم (ماده كنتراست يوني-هيپاك) با فيكول يا تركيب متريزوات سديم با فيكول (ليمفوپرپ) عمدتاً در گزينش سلول‏هاي خوني به كار گرفته مي شود. يك ماده گزينشي نسبتاً جديد، پركول است كه از كلوئيد سيليس پلي ديسپرس با پوشش پولي ونيل پيرليدن (PVP) تشكيل شده و كاربرد فراواني پيدا كرده است. پوشش PVP سبب خنثي كردن نسبي سيليس از نظر پايداري PH و استقامت يوني فيزيولوژيكي مي شود. براي ديدن مباحث مربوط به انواع سلول‏هايي كه توسط پكرول از خون و ارگانهاي مختلف ديگر جدا شده اند به منابع مراجعه كنيد. اين مواد گزينش گر به عنوان نخستين گام در كاهش سلول سازي تركيبات سلولي به نحوي كه ديگر روش‏هاي خاص جدا سازي را نيز بتوان به خدمت گرفت استفاده ميشوند.

اين مواد گرادياني اجازه تشكيل محلول‏هايي با چگالي مناسب براي باند كردن سلول‏ها طبق چگالي شناوري (buoyant) بدون اينكه سلول‏ها تحت هيچ گونه تنش اسمزي يا يوني قرار داشته باشند را مي دهد. ماده گرادياني قادر است كه بر اساس چگالي يا اندازه سلول‏ها را تفكيك كند. براي گزينش بر مبناي چگالي ماده گرادياني به نحوي ساخته مي‏شود كه حيطه چگالي آن كل محدوده چگالي سلول‏هاي موجود در تركيب را در بر ميگرد. اين فرايند جهت اطمينان از اين مسئله است كه تحت نيروي سانتريفوژ اعمال شده، سلول‏ها به سطح تعادلي تحت عنوان سطح ايزوپيكنيك رسيده اند كه در اين سطح چگالي محيط ميشوند. تحت اين شرايط اندازه نقش مهمي را ايفا نمي‌كند.

چگالي يك سلول مي تواند توسط خاصيت اسمزي محلول تحت تأثير قرار بگيرد. در يك محيط‏هايپرتونيك (پرفشار) سلول كوچك شده و چگالي شناوري به واسطه حذف آب افزايش مي يابد زيرا ماده‏هايپرتونيك سلول‏ها را متورم كرده و چگالي شناوري آنها را كاهش مي دهد. ميزان اسمزي يك ماده بخصوص در هنگام جداسازي ايزوپيكنيك بايد كنترل شود. مشخصه اين مواد نشانگر توانايي آنها در رسيدن به كنترل غير وابسته به چگالي و خاصيت اسمزي است.

جداسازي سلول‏ها بر اساس اندازه يا سرعت نيازمند اين است كه ماده گرادياني كم چگال تر از سلول‏هاي موجود در تركيبي باشد كه بايد جداسازي شود. تحت اين شرايط گرادياني سلول‏ها وضعيت ايزوپيكنيك نداشته و جداسازي بر اساس اندازه مشخص مي شود به اين صورت كه سلول‏هاي بزرگ سريعتر از سلول‏هاي كوچك جابجا مي شوند. اين وضعيت قبل از رسيدن سلول‏ها به كف لوله متوقف مي شود. جداسازي ايزوپيكنيك به سرعت سانتريفوژ بالاتري نسبت به جداسازي سرعتي نياز دارد. اگر سلول مورد نظر به سرعت‏هاي بالا حساس باشد در جداسازي ايزوپيكنيك بايد توجه كافي مبذول شود.

براي دستيابي به موادي با چگالي‏هاي مختلف از روشهاي پيوسته يا ناپيوسته استفاده مي شود. گراديان‏هاي ناپيوسته، تغييرات ناگهاني و يا واسطه‏هايي را در طول لوله سانتريفوژ ايجاد مي كنند. تغيير يك چگالي خاص در هنگامي كه ماده جداساز به عنوان بالشتك عمل مي‌كند مي تواند عمل جداسازي سلول را انجام دهد مانند وضعيت لويكوسيت‏هاي تك هسته اي در زمان استفاده از گراديان پكرول. همچنين مي توان از يك سري تغييرات ناگهاني چگالي براي جداسازي اعصاب دوپا مينرژيك شكمي و سينه اي جنين موش و جداسازي اسپرم بارور X از اسپرم بارور Y استفاده كرد. گراديان‏هاي چگالي ناپيوسته بدليل جمع شدن سلول‏ها در حد فاصل‏ها مي توانند سبب ايجاد عوامل خارجي ناخواسته (آرتيغكت) شده و شناخت سلول‏هاي با چگالي متفاوت وابسته به ناهمساني چگالي در گراديان‏هاي ناپيوسته را مشكل مي سازند. گراديان‏هاي پيوسته به وسيله گراديان سازها يا به صورت پكرول توسط گراديان‏هاي خود ساز شكل ميگرند. پكرول در اثر نيروي سانتريفوژ بيشتر از g10000 شروع به ته نشيني مي‌كند. و از آنجائي كه پكرول يك كلوئيد چند طيفي (پلي ديسپرس) است ذرات با نرخ‏هاي متفاوت ته نشين مي شوند كه سبب ايجاد گراديان نرم ميشود. تحت اين شرايط ممكن است سوسپانسيون سلول با پكلرول آميخته شده و عمل سانتريفوژ در سرعت‏هاي بالا منجر به توليد گرادياني شود كه پس از آن، سلول‏ها بر اساس گراديان شكل گرفته جدا مي شوند. در اين مورد دو نگراني وجود دارد. اول اينكه نرخ بالاي سانتريفوژ ممكن است به سلول‏ها آسيب برساند و دوم اينكه احتمال جذب پكرول توسط ليزوزوم‏ها وجود دارد البته پكرول جهت جداسازي انواع ليزوزومال‏هاي با چگالي‏هاي مختلفي در هپاتوسيتهاي موش بدون تأثير در چگالي ليزوزوم‏ها به كار برده مي شود.

-نشانه‏هاي اختصاصي (ماركر)سلول                   UNIQUE CELL MARKERS

ساختمان سلول‏ها در بافت‏ها با توجه به عملكردشان در درون سلول ناهمگن است. اين ساختارها نه تنها نشانگر عملكرد منحصر به فرد سلول‏هاست بلكه وسيله اي براي تشخيص آنها مي باشد بخصوص اگر اين ساختار در سطح سلول باشد. گزينش استثنائي پادتن‏هاي منوكلونال (تك تاگي) سبب ايجاد روش‏ها و تجهيزات مختلفي شده است كه به منظور بهره برداري از اين اختلافات به كار برده مي شوند.

-دسته بندي سلول فلورسنت فعال شده (FACS)

Fluorescent- Activated Cell Sorting (FACS)

دسته بندي سلول فلورسنت فعال شده به روش سلول سنجي (سايتومتري) روان انجام مي شود كه يكي از پيشرفته ترين تجهيزات در جهت بهره برداري از تكنولوژي پادتن‏هاي منوكلونال مي باشد. عملكرد اين دستگاه بر اساس قابليت ايجاد جرياني از سلول‏هاي منفرد است كه به طور انتخابي توسط صفحات منحرف كننده با بارهاي مخالف قابل تغيير جهت هستند. در ابتدا تركيبي از سلول‏ها با پادتن‏هاي مونوكلونال جفت شده با نشانه‏هاي فلوروسنتي نگهداري ميشود، سپس سلول‏هايي كه داراي اپيتوپ (epitope) مناسب هستند با پادتن‏هاي نشان دار باند مي شوند. در اين دستگاه تركيب به صورت جرياني از سلول‏ها در مي آيند كه به وسيله مبدل لرزشي به قطره‏هاي كوچك شكسته مي شود. سپس باريكه ليزر به سلول‏ها تابانده شده و پرتو حاصل توسط فوتومالتي پلير (تشديد كننده نوري) دريافت مي گردد و متعاقباً پردازش انجام مي گيرد. سلول‏ها در خلال اين پردازش به نحوي باردار مي شوند كه به خوبي توسط صفحات باردار منحرف كننده قابل انحراف باشند. از آنجا كه دستگاه قادر به انتگرال گيري كليه اطلاعات است پس از برخورد باريكه ليزر با سلول‏هاي مورد نظر، يك بار مختصر به صفحات منحرف كننده اعمال مي شود كه نتيجه آن انحراف سلول‏هاي نشان دار و از دست رفتن سلول‏هاي بدون نشان است به طور كلي عمل جداسازي در دستگاه FACS بر اساس هر گونه خصوصيت سلولي كه توسط پراكندگي يا انتشار نور باشد انجام مي‏گيرد. با توجه به پيچيدگي دستگاه، عمل دسته بندي مي تواند بر روي بيشتر از يك پارامتر انجام شود، از جمله، اندازه گيري شكل سلول اندازه سلول و انواع ويژگي‏هايي كه توسط برچسب گذاري فلورسانس (نشانه گذاري فلورسانس) قابل بررسي هستند. شناسايي سلول‏ها در سيستم هماتوپوئيتيك (خون سازي) با استفاده از روش سلول سنجي روان انجام پذيرفته است. اين سلول‏ها به خوبي قابل تشخيص بود و پادتن‏هاي مونو كلونال فراواني در تضمين نتيجه بخش بودن آنها وجود دارد. اين شناخت به همراه ايزولاسيون مي تواند كاملاً مؤثر بوده و در نتيجه سلول‏هاي كم چگالي توسط اين روش به خوبي تفكيكي مي شوند.

-دسته بندي رشته اي ايمني مغناطيسي و دسته بندي سلول مغناطيس فعال شده (MACS)

 Immunomagnetic Bead Sorting and Magnetic Activated Cell Sorting (MACS)

روش دسته بندي رشته اي ايمني مغناطيسي و دسته بندي سلول مغناطيسي فعال شده از پادتن‏هاي مونوكلونال و ديگر مولكول‏هاي گزينش شده با خاصيت مغناطيسي براي گزينش سلول سود مي برد. به طور كلي، در اين روش تركيبي، آميزش سلول با پادتن اصلي مونوكلونال براي اپيتوپ معيني نگهداري مي شود. رشته‏هاي مغناطيسي با پادتن‏هاي ثانويه گوناگوني پوشيده شده و سلول‏ها و رشته‏ها با هم رشد مي يابند. سلول‏هاي نشاندار ويژه با اتصال به ذرات مغناطيسي پادتن ثانويه را حمل مي كنند. لوله اي كه تركيب فوق را حمل مي‌كند در مقابل مغناطيس قرار داده مي شود در نتيجه رشته‏هاي حامل سلول به سمت مغناطيس كشيده مي شوند. سلول‏هاي غير متصل به رشته مغناطيسي را مي توان به بيرون منتقل كرد، اين فرايند را مي توان چندين بار تكرار نمود تا سلول‏هاي غير متصل به كلي خارج شوند.مثالي از اين روش در مطالعات تصفيه سلول‏هاي  از جزاير لانگرهانس موش آورده شده است. يك نمونه از گزينش غير پادتني كه رشته مغناطيسي را مورد استفاده قرار مي دهد در مطالعاتي كه در آن سلول‏هاي اندوتليال ميكروشرياني از داخل جزاير لانگرهانس پاكسازي شد، آمده است. رشته‏هاي پوشيده شده با آلگولتينين-1 اولكس يوروپاوس (Ulex europaus) براي باند كردن سلول‏هاي اندوتليال شريان‏هاي بسيار كوچك استفاده شدند. اين ايزولاسيون نشان دهنده ويژگي منحصر به فرد سلول‏هاي اندوتليال است كه نظريه مبني بر اهميت محل آناتومي درحالت فنوتيپيك سلول‏هاي مشابه را تأئيد مي‌كند. گزينش مي تواند مثبت يا منفي باشد: مثبت يعني سلول مورد نظرنشان دار بوده و تحت تأثير ميدان مغناطيس قرار مي گيرد و منفي يعني آلاينده سلول غالب نشان دار بوده و باند شده است و سلول مورد نظر پاك گرديده است(منتقل گرديده است.)

مزيت گزينش منفي اين است كه سلول‏هاي مورد نظر به رشته‏هاي مغناطيسي پيچيده نشده ولي رشته‏هاي بزرگ ممكن است بر اتصالات بعدي روي سطوح كشت بافت تأثير بگذارند. اگر نياز به گزينش مثبت باشد پاكسازي رشته‏ها از سلول‏هاي مورد نظر صورت گرفته و اين عمل با استفاده از ضدسرم ضد فب (anti-Fab) انجام مي شود. رشته‏ها توسط گوارش آنزيمي پاك مي شوند اما اين كار ممكن است بر سلول تأثير بگذارند. دو روش ديگري به نام گزينش سلول (CELLection) DNA كوتاه بين رشته اي و پادتن توسط دي (DNASE) از هم باز مي شوند. در اين روش رشته‏هاي داينا (Dyna beads) از داينال (Dynal) مورد استفاده قرار مي گيرند. طراحي ديگر رشته MACS كه توسط ميلتني بيوتك با مسئوليت محدود صورت گرفت اين معايب را ندارد اگر چه رشته‏هاي داينا از ديدي ديگر با توجه به داشتن توانايي در احياي سريع سلول يك مزيت به حساب مي آيند. استفاده از رشته‏هاي ميلتني nm 50 به يك ستون گزينش نياز دارند. در قسمت نخست ستون سلولهايي قرار دارند كه داراي نشان‏هاي ويژه هستند. باقيمانده ستون را تا زماني كه ميدان مغناطيسي برقرار است، رشته مغناطيسي تشكيل مي دهد. ستون فوق قابل شستشو بوده و در اثر شستشو سلول‏هاي غير متصل به رشته مغناطيسي خارج مي شوند. به محض برداشتن ميدان مغناطيسي از روي ستون سلول‏هاي متصل به رشته شسته مي شوند. مطالعات انجام شده بر روي رشته‏هاي داينا و سيستم ستون‏هاي ميلتني از ميدان‏هاي نسبتاً مغناطيسي مرتبط با اين ذرات بهره مي برند. در اين دو مرحله گزينش دو نوع سلول نشانه دار سطحي بدون حذف اولين مجموعه از رشته‏هاي مغناطيسي به كار برده مي شوند. در ابتدا گزينش مثبت با سيستم ميلتني رخ مي دهد كه توسط گزينش مثبت يا منفي رشته‏هاي داينا دنبال مي شود. توان مغناطيسي گزينش گر داينال قادر به جذب رشته‏هاي بزرگ تر داينا بوده اما توانائي جذب رشته‏هاي كوچك ميلتني را ندارد.

دستگاه FACS براي دسته بندي سلول پرهزينه است. بنابراين دسته بندي مغناطيسي به عنوان روش ايزولاسيون و گردآوري سلول در هنگام استفاده از پادتن‏هاي مونوكلونال براي جداسازي سلول‏ها ترجيح داده مي شود. هر دو اين روش‏ها براي كار با سيستم سلول خون سازي نسبت به سلول‏هاي بافت‏هاي ديگر سازگارتر هستند. سلول‏ها سيستم خون سازي تا حدود زيادي با ماتريس برون سلولي (extracellular matrix) ارتباط نداشته و به خوبي براي سوسپانسيون (تعليق) كارآيي دارند. اين دو مشخصه شرايط لازم براي بهره گيري از مزاياي اين روش‏ها را فراهم مي‌كند. با اين وجود سلول‏هاي بافت‏هاي سخت ذيل توسط اين گونه روشهاي ايمني گزينش مي شوند: سلول‏هاي كشت يافته ماهيچه‌اي سلول‏هاي اندوتليال آئورت، گزينش سلول‏هاي لومينال ومايواپيتليال پستاني، گزينش بخش‏هاي مختلف نفرون پروگزيمال، غني سازي زير جمعيت‏هاي سلول‏هاي اپيتليال تنفسي و گزينش سلولهاي حاوي كالي كرين از سلول‏هاي لوله اي كليوي محدوديتي كه براي سلول‏هاي غير خون ساز وجود دارد چسبندگي بيشتر آنهاست كه اجازه شارش مناسب در ستون‏ها را نمي دهد. گردش جريان در FACS از سلول‏هاي توده اي جلوگيري مي كند، بدين ترتيب سبب بهبود خلوص مي گردد.

از آنجا كه ميزان نشانه‏هاي اختصاصي سلول در بافت نسبت به زمان گذرا است اين روش بايد به سرعت در روند ايزولاسيون اعمال شوند تا احتمال حضور نشانه‏هاي مطلوب افزايش يابد. سلول‏هاي اپيتليال در شرايط كشت سلولي استاندارد قطبيت و عملكرد متمايز خود را از دست مي دهند، هپاتوسيت يك نمونه قابل ذكر در اين مورد است. انواع ديگر سلول‏ها نيز با حالت‏هاي مشابه به شرايط كشت سلولي استاندارد پاسخ مي دهند. باقي ماندن سلول‏ها به حالت تعليق (سوسپانسيون) براي مدت زمان طولاني مي‎تواند آنوئيكها را فعال كرده و زيست پذيري و توليد سلول را كاهش دهد. علاوه بر اين، سلول‏هاي تحت آزمايش FACS و گزينش ايمني مغناطيس سلول، نشان دهنده تغييراتي در يكپارچگي غشاء بوده كه به واسطه نيروهاي هيدروديناميك يا ميدان‏هاي مغناطيسي ايجاد شده است. همچنين رشته‏ها مي توانند با مصرف آنتي ژن مقادير قابل ملاحظه اي از آن را از سطح سلول‏هاي زنده و فعال جدا كنند. ايزولاسيون آئوزينوفيل‏ها (آئوزين پذيرها) توسط MACS نشان دهنده تضعيف عكس العمل نسبت به جاذب‏هاي شيميايي LTB4 و PAF است در حالي كه تصفيه اوليه پكرول به اين صورت بر ائوزينوفيل تأثير نمي گذارد.

يكي از تفاوت‏هاي بين FACS و MACS اين است كه FACS مي تواند كمي (سنجش پذير) باشد. از آنجا كه درجه فلورسانس مي تواند معياري براي FACS باشد، امكان ايزوله كردن سلول با درجات مختلف شدت فلوروسانس وجود دارد. در مورد MACS، مسأله به فرم همه يا هيچ است. البته تركيب MACS و سانتريفوژ با گراديان چگالي مي تواند تمايزاتي بر اساس درجه ميزان آنتي ژن موجود در سطح فراهم كند. سلولي كه ميزان آنتي ژن بيشتري داشته باشد داراي رشته‏هاي متصل بيشتري بوده و درنتيجه چگالي بالاتري خواهد داشت، چنين سلولهايي در گراديان چگالي سريعتر ته نشين مي شوند.

تركيب فرايند دسته بندي سلول فعال شده فلورسانس و رشته مغناطيسي براي ايجاد تصفيه بهتر لازم نيست. قرار دادهاي تأئيد نشده در مورد موضوع خون سازي براي همه سلول‏هاي بافت‏هاي سخت مناسب نيست. شايد توسعه روش‏هايي براي غلبه بر محدوديتهاي بالا لازم باشد. چنين تلاشي كاملاً مفيد بوده و در مواردي ضروري است. سلول‏هاي اجدادي (Progenitor) تقريباً در كليه اندام‏هاي يك ارگانيزم رشد يافته پيدا مي شوند. ايزولاسيون اين سلول‏ها به روش‏هاي ايزولاسيون حساس نيازمند است. اين سلول‏ها به سختي قابل رؤيت بوده و بنابراين روش‏هاي ماكروايزولاسيون كه ايزولاسيون سنتي كشت سلولي را شامل مي شوند مناسب نخواهند بود قرار دادهاي موجود براي سلول‏هاي خون ساز مي تواند پايه اي براي پيشرفت‏هاي بيشتر باشد. با ملاحظه شرايط ذكر شده فوق، اين قرار دادها را مي توان تقريباً براي هر سلولي كه به طور مناسب توسط نشانه‏هاي اختصاصي نشان دار شده باشد به صورت موفقيت آميز توسعه داد.

-جداسازي                                                                                                                     Panning

جداسازي روش ايمني ديگري است كه در آن لكتين‏ها براي باند كردن انواع سلول‏هاي خاص مانند سلول‏هاي اپيتليال لثه پيوندي يا سلول‏هاي اپيتليال آرواره اي ‍(آلوئولار) نوع II مورد استفاده قرار مي گيرند. ظروف كشت سلولي با پادتن مناسب يك نشانه خاص سلولي تركيب مي شوند. سپس مخلوط سلول به ظروف كشت سلولي پوشيده شده با پادتن اضافه مي گردد. در اين حالت سلول‏هاي نشانه دار به ظرف چسبيده و سلول‏هاي بدون نشانه به آساني خارج مي شوند. اين روش به قابليت سطحي كه پادتنها به آن مي چسبند بستگي دارد، تا كمترين جاذبه را براي سلول‏هاي ناخواسته داشته باشد، در غير اين صورت تمايز بين سلولي كاهش مي يابد. عمل جداسازي در مدهاي مثبت يا منفي قابل استفاده است؛ وضعيت مثبت براي انتخاب سلول‏هاي مطلوب و منفي براي انتخاب و خارج سازي سلول‏هاي نامطلوب در نظر گرفته مي شود. به منظور خارج سازي سلول‏هاي جدا شده از طرق آنزيمي و مكانيكي مي توان بهره برد. اين روش براي ايزوله كردن سلول‏هاي تروفوبلاست انسان از تركيب پرزهاي جفت جفت تريپسين زده سلول‏هاي آغازين ژرم، و فيبروبلاست ها از تركيب كراتينوسيت، براي گزينش مثبت سلولهاي لانگرهانس و كراتينوسيتها و لنفوسيت‏ها مورد استفاده قرار ميگيرد.

-مشخصه‏هاي غذايي و متابوليكي (سوخت وساز)

از نيازهاي غذايي و متابوليكي گوناگون سلول‏هاي مختلف نيز مي توان به منظور گزينش در خلال ايجاد كشت‏هاي اوليه بهره گرفت. در اين موارد شرايط از اهميت ويژه اي برخوردار هستند زيرا پاسخ سلول‏ها به اين وسايل ممكن است به شرايط معيني احتياج داشته باشد. براي مثال، سميت مورد نظر ممكن است در حضور سرم به واسطه داشتن پتانسيل سم زدايي ظاهر نشود. همچنين از آنجا كه سرم شامل مجموعه گوناگوني از مواد غذايي است، بهره گيري از احتياجات غذايي مختلف در حضور سرم دشوار مي شود. (تضعيف مي شود).

-متابوليك (سوخت و ساز)METABOLIC                                                      

ايزوزيم‏ها (Isozymes) به طور ناهمگني در ميان انواع مختلف سلول‏ها توزيع شده اند استرازهاي غير خاص نمونه‏هاي خوبي از اين پديده به شمار مي روند. حالت‏هاي متفاوت استراز ايزوزيمها در سلول‏هاي اندتليال و پريسايت‏ها مبناي اصلي تمايز بين اين دو نوع سلول است. غلظت mM 50 ال- لوسين متيل استر براي سلول‏هاي اندوتليال سمي بوده ولي براي پريسايت‏ها سمي نمي باشد و منجر به ته نشيني سلولهاي اندوتليال مي گردد. به طور مشابه ال- لوسين- ال- لوسين متيل استر در مقايسه با سلول‏هاي B و T كمك كننده ترجيحاً لنفوسيت‏هاي سمي را مي كشد. ليزوزمال تيول پروتئاز دي پپتيديل پپتيدازI، مي تواند ال- لوسين- ال- لوسين متيل استر را به محصولات هضم كننده غشاء تبديل كند. در غلظت‏هاي بالا آنزيم در لنفوسيتهاي سمي بيشتر از سلوهاي ديگر ظاهر مي شود كه در نهايت ته نشين مي شوند. همچنين تحليل گرانولوسيت‏ها و مونوسيت‏ها از سلول‏هاي تجمع يافته افرسيس را مي توان با تكوين در كنار ال- فنيلالانين متيل استر هيدروكلرايد به دست آورد. سپس سلولهاي CD34+ به وسيله ايزولاسيون رشته مغناطيسي تصفيه مي شوند. پالايش اوليه گرانولوسيتها و مونوسيتها بازدهي ايزولاسيون را افزايش مي دهد.

آلاينده فيبروبلايست يك مشكل متداول در كاشت بافت مي باشد. تلاش براي كنترل رشد فيبروبلاست با استفاده از بهره برداري از فقدان فعاليت ال-آمينو اكسيداز، آنزيمي كه دي- والين را به ال- والين تبديل مي‌كند، انجام مي شود. سلول‏هاي مطلوب نيازمند انجام اين تبديل به طور مناسب هستند. در ماده اي كه دي والين جايگزين ال-والين مي شود قابليت گزينش مشاهده مي شود. البته گزارشات ضد و نقيضي در اين مورد وجود دارد. فيبروبلاست‏ها از گليوبلاستوماي چند شكل و اوليگودندروگليوما در محيطي كه در آن دي- والين جايگزين ال- والين مي شود كشت مي گردد و با محيط استاندارد حاوي ال-والين مقايسه مي شود. هر سه نوع سلول در برابر دي- والين مقاومت كرده و تغيير شكل مورفولوژيكي قابل ملاحظه اي دارند. همچنين با وجود اينكه احتمال توقف فيبروبلاست‏ها توسط دي-والين وجود دارد اما آنها لزوماً كشته نشده و ممكن است با قرار گرفتن دوباره سلول در محيط حاوي ال-والين شروع به رشد نمايند. در انتها نتيجه ميگيريم كه دي والين جلوي رشد فيبروبلاست انساني را در محيط آزمايشگاه نمي گيرد. قبل از انجام هر گونه تلاشي براي متوقف كردن رشد فزاينده فيبروبلاست توسط ماده دي- والين، عوامل متعددي بايد در نظر گرفته شود. اول اينكه دي والين تهيه شده بايد داراي آلاينده ال- والين كمي باشد. مقادير كم ال-والين ممكن است سبب كاهش سرعت تكثير شود اما باعث طولاني شدن بقا مي گردد. همچنين غلظت بهينه دي-والين ممكن است برابر غلظت اصلي ال-والين نباشد. ميزان تأثير دي-والين به اندازه ايزومر-ال نمي باشد. ميزان بازدهي جابجائي نسبي دي- والين و ايزومر –ال يكسان نبوده و در درون سلول، دي والين به نوع ال تبديل مي شود. زمان مورد نياز براي اين فرايند سبب افزايش الزامات براي نوع دي مي گردد. به طور ايده آل در صورت امكان بهتر است ماده اي عاري از دي- ال- والدين تهيه شده و سپس با غلظت مناسب دي والين مورد نياز تيتر كرد.

هپاتوسيت شامل يك چرخه مؤثر اوره مي باشد. در نبود ال- آرژنين هر يك از چرخه‏هاي مياني اوره قادر به بازسازي ال-آرژنيني است. از نظر سنتي براي جايگزيني ال- آرژنين از ال- اورنيتين استفاده مي شود. ديگر آلاينده‏هاي بالقوه سلول در ايزولاسيون هپاتوسيت داراي فعاليت چرخه اوره قابل ملاحظه اي نبوده و در نبود ال-آرژنين زنده باقي نمي مانند. ظاهراً احتمال رخ دادن عمل تغذيه متقابل(cross feeding) در هنگامي كه هپاتوسيتها ماده را براي سلول‏هاي آرژنين غير قابل تكثير آماده مي كنند بسيار كم است.

سودمندي ماده عاري از ال- آرژنين بستگي به چرخه عملياتي اوره دارد. هر گونه آسيب سلولي كه به طور مستقيم يا غير مستقيم بر چرخه اوره تأثير بگذارد بر زيست پذيري هپاتوسيتها تحت شرايط عاري از آرژنين نيز اثر مي گذارد. اگر شك داشته باشيم كه وجود هپاتوسيتها مطلوب يا نامطلوب است استفاده از ماده عاري از ال-آرژنين توصيه نمي شود. به طور كلي اين سطح گزينش ضروري نيست، زيرا هپاتوسيتها را مي توان در كشت اصلي با بهره گيري از اختلاف فاحش اندازه سلول بين هپاتوسيتها و ديگر سلولهاي كبد با خلوص بالا به دست آورد.

شرايط كشت سلولي ديگر كه براي انواع سلولهاي مختلف انتخاب مي شود خاصيت اسمزي ماده است. سلول‏ها در برابر تغييرات اسمزي عكس العمل‏هاي تطبيق پذير ولي غير يكسان دارند. سلولهاي سرتولي ايزوله شده از لوله‏هاي تخمدان حاوي سلولهاي ژرم آلاينده مي باشند. ارائه محيط‏هاي كشت به يك محيط‏هايپوتونيك (كم كشش) براي مدت زمان معين منجر به پاك سازي انتخابي سلول‏هاي ژرم بدون تأثير قابل ملاحظه بر سلول‏هاي سرتولي مي شود. همچنين سلول‏هاي اپيتليال تجمع يافته مجراي دروني كليه زياد تطبيق پذير نيستند. علاوه بر اين مشاهده شد كه غلظت NaCl مي تواند بر افزايش سلول‏هاي اپيتليال تجمع يافته مجراي كليدهاي نوزاد خرگوش تأثير بگذارد.

-تغذيه ايNUTRITIONAL                                                                              حتي اگر سلول‏هاي تحت كشت با محيط آزمايش سازگار شوند. مشخصه‏هاي مهم فنوتيپ بدن را حفظ مي كنند مانند آنچه در مورد سلولهاي پروستات و نايژك‏ها نشان داده شده است. توانايي سلول‏ها درتكثير و بيان مشخصه‏هاي منحصر به فرد در كشت سلولي به فاكتورهاي رشد، سايتوكين‏ها، هورمونها، ماتريس‏هاي برون سلولي و تركيبات غذايي ماده وابسته است. درك عمكرد اين اجزاء براي فهميدن عملكرد و بقاي سلول‏ها در محيط آزمايشگاه لازم است.

شرايط غذايي سلول مورد نظر شامل تيتراسيون ميزان بهينه كليه اجزاء ماده مي باشد. براي دستيابي به اين هدف منحني‏هاي رشد با پاسخ‏هاي دوزي مختلف در چگالي‏هاي سلول كلونال (بافت- زاد) مورد نياز خواهد بود. شرايط كلونال به خاطر اينكه چگالي‏هاي بالاي سلولي ماده و معايب مبهم آن را تحت تأثير قرار مي دهد. مهم هستند اين فعاليت در هنگام استفاده از روش‏هاي سنتي بسيار وقت گير است. بهره گيري از سخت افزار و نرم افزار موجود براي تصويربرداري با ظرفيت پذيرش بالا مي تواند به طور قابل توجهي زمان مورد نياز براي تكميل تيتراسيون‏ها را كاهش دهد.

توسعه محيط عاري از سرم نشان دهنده وجود شرايط غذايي متفاوت براي انواع مختلف سلول است. با وجود مقادير زياد سلول‏هاي مورد نياز با اجزاء كيفي مشابه در محيط بازال خود شرايط كمي آن‏ها متفاوت خواهد بود. سلول‏هاي مختلف در يك ارگانيزم چند سلولي به وسيله مايع برون سلولي حاوي اكسيژن، دي اكسيد كربن، گلوكز، لاكتيت، آمينواسيدها و مواد غذايي مهم ديگر، فاكتورهاي رشد و هورمونهاي مشتق شده از پلاسما و يا سلولهاي محيط احاطه شده اند. از آنجا كه سلول‏هاي مختلف، برنامه‏هاي متابوليكي متفاوتي دارند اين محيط‏ها نيز متفاوت خواهند بود. براي مثال فيبروبلاست‏ها و كراتينوسيتهاي يك نمونه پوستي در محيط‏هاي مربوطه تكثير نمي شوند. تفاوت در غلظت كلسيم و آدنين ظاهراً مؤثرترين عامل در رشد انتخابي مي باشد. رشد بهينه كراتينوسيتها در غلظت‏هاي نسبتاً كم كلسيم رخ ميدهد. غلظت كلسيم بهينه براي فيبروبلاست سبب لايه لايه شدن كراتينوسيتها شده و آنها ديگر قابليت عبور سريال (زنجيروار) را در زماني كه غلظت بهينه كلسيم براي كراتينوسيتها در كمك به تكثير فيبروبلاست بسيار كم است نخواهد داشت. همچنين سلول‏هاي اپيتليال پستاني، فيبروبلاست‏ها توسط عكس العمل‏هاي متفاوت شان نسبت به شرايط زير بستري و اجزاء ماده از همديگر تشخيص داده مي شوند.

كلسيم اثر قابل ملاحظه اي پر وضعيت فنوتيپ سلول اپتيتال مي گذارد. غلظت نسبتاً بالاي كلسيم سبب لايه لايه شدن سلول‏ها شده و همان طور كه در سلول‏هاي اپيتليال مري موش مشاهده شد، عمل جداسازي را آسان مي‌كند. كراتينو سيت‏هاي سطحي پوست (اپيدرمال) موش با ميزان بهينه mM03/0 رشد كرده و در نهايت در mM0/1 كلسيم جدا مي شوند. سلول‏هاي اوروتليال انسان در mM06/0 كلسيم تكثير يافته و در غلظت‏هاي بالاتر جدا و پوسته مي شوند. سرم نيز مي تواند سلول‏هاي اپيتليال را از هم جدا كند. سلول‏هاي اپيتليال نايژك يك انسان طبيعي در حضور سرم به صورت پوسته پوسته جدا شده در حالي كه سلولهاي كار سينوم ريه در حضور سرم جدا نمي شود. همچنين شرايط كشت كه به رشد سلولهاي اپيتليال لومينال طبيعي كمك مي‌كند از رشد سلول‏هاي نئوپلاستيك حمايت نمي كند.

در يك محيط عاري از سرم يا مشخص از نظر شيميايي، تركيبات غذايي تاثير شديدي بر رفتار سلولي مي گذارد. شرايط تغذيه اي خاص، تكثير سلولي را محدود مي‌كند. فاكتورهاي رشد و مولكولهاي اطلاعاتي ديگر، همچنين ماتريس برون سلولي براي سلولهايي كه به طور طبيعي با آن در ارتباط هستند با تركيب ماده بازال بر هم كنش داده تا به يك فنوتيپ ويژه دست پيدا كند. اپيتلياي تجمع يافته در مجراي كليه جنيني به مواد مختلف با الگوهاي متفاوت پاسخ مي دهد. سري مواد MCDB 150 براي كراتينوسيتها توسعه يافته است. كاربرد MCDB 150 براي سلولهاي اپيتليال غده بزاقي موش نشان دهنده عدم توانايي براي زير كشت گسترده در محيط عاري از سرم است. البته افزايش سطوح بهينه در عصاره ايزولوسين به سلول‏هاي اپيتليال بزاقي اجازه مي دهد كه به صورت ترتيبي (سريال) زير كشت بروند.كراتينو سيتهاي انساني اثبات كننده نيازهاي غذايي به اينوزيتون و كولين تشديد اثر ميتوژنيك فاكتور رشد اپيدرمال توسط ال-سرين سرم، انسولين، فاكتور رشد كراتينوسيت وعصاره غده هيپوفيز گاوي است. همچنين حضور اتانولامين نياز سرمي سلولهاي اپيتليال پستاني موش را براي تكثير كاهش مي دهد. براي انواع سلولهايي كه نسبت به سرم عكس العمل نشان مي دهند سرم مي تواند با فراهم ‎آوردن مواد غذايي به محيط ميتواند سبب كم شدن نياز سرمي گردد.

در شرايط نبود سرم نياز غذايي آشكارتر مي گردد. غلظت بالاي پيروات ولاكتيت در كبد موش به همراه فعاليت گلوكز سنتز DNA را افزايش مي دهد. در نبود سرم مقدار كم سلنيوم براي رشد كلونال فيبروبلاست‏ها و خط سلول همستر چيني ضروري است. همچنين مقدار كم روي معدني با توجه به غلظت به كار رفته نشان دهنده اثر مثبت يا منفي آپوپتوسيس در تيموسيتهاي موش است. علاوه بر اين جداسازي پيگ پري اديپوسيت در محيط كم منيزيم دشوار است. همچنين گزينش سلول‏هاي لوله پروكسيمال انساني با استفاده از فرايند متابوليكي(سوخت و ساز) گلوكونئوژنيك موثر قابل دستيابي است. سلول‏هاي اوليه (اصلي) در يك محيط هورموني عاري از سرم بدون گلوكز يا انسولين كشت شده و در اين حالت سلول‏هايي كه قابليت گلوكز نئوژنزيس را ندارند آسيب مي بينند.

امكان ديگر بهينه سازي شيوه تركيبي است. يك ماده غني مانند M -199 Ham’s F12 يا سري MCDB به تنهايي يا به صورت تركيبي مورد استفاده قرا مي گيرند. اين عمل يك اقدام منطقي بوده و نتايج مطلوبي را به دنبال دارد. براي مثال سلول‏هاي ميان پوش روده اي كشت يافته در ماده M-199 عاري از سرم به منظور مطالعه تنظيم ترومبين ماتريس فعاليت متالوپروتناز استفاده مي شوند.

سلول‏هاي دانه اي (گرانولوزا) نارس خرگوش كشت يافته در M -199 براي بررسي آندروستندوئين و فيبرونكتين مختلف سلولي ايجاد شده توسط هورمون تحريك كننده غدد لنفاوي استفاده مي شوند. كاربرد تركيب دوليكو تصحيح شده توسط ماده ايگل و F12  Ham’s به همراه ماده بازال عصبي در محيط عاري از بافت در كشت نرون‏هاي بازال كولينرژيك پيشاني موش نشان داد كه مكمل فاكتور رشد به تنهايي براي جبران تركيب غذايي محدود كافي نيست. براي كشت اپيتليم انساني سطح تخمدان در يك محيط مشخص از تركيب ماده 199 يا MCDB 105 استفاده مي شود.

-نتيجه گيري

جهت تسهيل دشواري ذاتي عمل ايزولاسيون و گزينش تلاش‏هايي صورت گرفته است. بافت‏ها متغيرهاي طبيعي هستند كه در مقابل كشت از خود مقاومت نشان مي دهند. شرايط اوليه مانند عمر بافت و عملكرد بافت بسيار حياتي هستند. زيرا اين عوامل اثر تعيين كننده اي بر نتيجه نهايي دارند. محقق مي تواند با استفاده نادرست از شناسه‏ها و شرايط نامناسب در اتلاف زيست پذيري سهم داشته باشد. بنابراين در تعيين شناسه‏ها و فرايندها بايد دقت صد چنداني كرد. يكي از مقاصد اين فصل نشان دادن دشواري‏هاي ايزولاسيون و ملاحظاتي است كه در كسب موفقيت نهايي مفيد واقع مي شود.

توماس- پي- ريچارد سون، مارتين-سي- پيترز و ديويد- جي- موني

مهندسي بافت وعده بزرگ تهيه اندام هاي كاملاً عملياتي براي رفع مشكل كمبود عضو اهدايي را داده است. روش هاي متداول آزمايشگاهي تشكيل اين گونه بافت ها را معمولاً از دستگاههاي مختلط (هيبريد) شامل داربست هاي پليمري زيست تخريب پذير و سلول هاي اين بافت ها استفاده مي كنند. روش هاي متعددي در شكل دهي و پردازش پليمرها براي استفاده در مهندسي بافت توسعه يافته است كه هر فرايند مجزاي آن، داراي ويژگي و عملكرد منحصر به فردي در تشكيل داربست هاي مهندسي بافت است. با توجه به اين روش ها، پيشرفت هاي قابل ملاحظه اي در حال شكل گيري است كه يكي از مهمترين آنها اسفنج سازي گازي است. اسفنج سازي گازي به دليل قابليت تخلخل پذيري بالاي اسفنج هاي داربست پليمري بدون به كارگيري دماي بالا يا حلال هاي ارگانيك (آلي) حائز اهميت است. با حذف شرايط دماي بالا و حلال هاي آلي مي توان مولكولهاي زيست فعال بزرگ حاوي فاكتورهاي رشد را با حفظ فعاليت زيستي در پليمر مجتمع ساخت. (داربست هاي پليمري را ميتوان به عنوان حامل مواد مورد نياز پروتئين ها براي ايجاد پاسخ سلولي (براي مثال، جابجائي، (مهاجرت) و تكثير) و بستري براي چسبندگي سلول قلمداد كرد كه هر دو براي رشد بافت هاي آزمايشگاهي بسيار مهم هستند. فعاليت آزمايشگاهي ما بر استفاده از اين روش در پردازش كوپليمرهاي اسيدهاي لاكتيك و گليكوليك و كپسوله كردن پروتئين ها و پلاسميد DNA كد كننده پروتئين ها براي تغيير رفتار سلولي مورد نظر مهندسي بافت متمركز مي شود. اين فصل نظريه و روند اسفنج سازي گازي را با ملاحظه جنبه عملي پردازش اسفنج مورد بحث قرار مي دهد.

-پيشگفتار

اهداف مهندسي بافت فراهم سازي اندام هاي كارآمد يا جايگزيني قسمتي از بافت براي بيماراني با ضعف ‍(از كار افتادگي) اندام، آسيب يا بيماري وخيم است. محققان براي تهيه و تأمين جايگزين هايي كارآمد براي بافت، اقدام به تهيه پليمرهايي نموده اند كه در آنها گونه هاي سلولي متفاوت (مثل سلولهاي استخوان زا و غضروف زا و غيره) را كشت داده اند؛ و بدين منظور كليه رهيافت هاي مبتني بر آزمونهاي داخل بدن و يا خارج بدن موجود زنده        (in vivo , in vitro) مد نظر قرار گرفته است. علاوه بر اين، پيشرفت هاي قابل ملاحظه اي در استفاده از تركيباتي كه سبب تحريك بافت خود شخص گيرنده در پاسخ به دستگاه شده و توليد بافتي كه تقريباً عمليات معادل بافت صدمه ديده يا غايب را انجام مي دهد صورت گرفته است.

اهداف استراتژي فعلي، توسعه داربست هاي زيست تخريب پذيري است كه در آنها يا سلول ها به طور مستقيم كاشته شده و يا فاكتورهاي القايي بافت (براي مثال، فاكتورهاي رشد) كپسوله مي شوند، كه البته تركيب هر دو استراتژي فوق نيز در نظر گرفته مي شود. در اين روش فرض مي شود كه پليمر ويژگي هاي ساختاري ضروري را براي نفوذ، تكثير سلولي، ته نشيني ماتريس برون سلولي و سازمان دهي سلولي كه در نهايت منجر به يك بافت سازمان دهي شده كاملاً كارآمد مي شود فراهم آورد. فرض ديگر اين است كه اين پردازش هاي سلولي برابر با نرخ تخريب پليمر يا نزديك به آن باشد. در سال هاي اخير ساختارهاي پليمري متعددي (براي مثال، فيلم ها، اسفنج ها و غيره) توسط پردازش هاي گوناگون توسعه يافته و قابليت استحكام مكانيكي، تخلخل پذيري، نرخ تركيب و آزاد سازي مولكول هاي زيست سازگار آنها مورد آزمايش قرار گرفته است. اين كار نشان مي دهد كه روش هاي مختلف ساخت پليمر داراي قابليت هاي مجزايي براي دستيابي به هدف نهايي يعني جايگزيني بافت كارآمد هستند. اين روش ها به وسيله پارامترهاي سهولت پردازش، تخلخل پذيري پليمر، نسبت هاي متغير سطح به حجم و سازگاري با مولكول هاي زيست فعال از يكديگر تميز داده مي شوند. در بخش بعدي روشهاي متداولي كه براي كاربردهاي مهندسي بافت توسعه داده شده اند بطور خلاصه بازنگري شده و سپس روش اسفنج سازگاري در بخش هاي آتي تشريح مي شود. اين فصل بر پردازش پلي- لاكتيك- كوگيكوليك اسيد (PLGA) كه يك ماده بسيار متداول در داربست هاي مهندسي بافت است تمركز مي‌كند.

-پردازش پليمرهاي به كار رفته در مهندسي بافت

پليمرهاي متنوعي در مهندسي بافت مورد استفاده قرار مي گيرند اما تأكيد اين فصل بر پردازش PLGA است. پليمرهاي حاوي اسيد لاكتيك و اسيدگليكوليك به طور گسترده در مهندسي بافت به كار رفته و به مدت 25 سال به عنوان نخ بخيه زيست تخريب پذير مورد استفاده قرار گرفته اند كه نشان دهنده زيست سازگاري مناسب آنهاست. شيوه هاي مختلفي با مزايا و مضرات شاخص براي ساخت داربست هاي PLGA توسعه يافته كه به غير از روش اسفج سازگاري بقيه به پردازش PLGA در حالت مايع نيازمند است. اين روش هاي پردازش به صورت خلاصه در اينجا مورد بازنگري قرار مي گيرند. چهار روش پر كاربرد عبارتند از؛ قالب گيري حلال، تفكيك فاز، قالب گيري مذاب و اسفنج سازي گازي كه به طور مفصل در بخش هاي بعدي مطرح مي شوند. هر كدام از اين روشهاي پردازش داراي قابليت هاي خاصي در مهندسي بافت هستند.

قسمت باقيمانده فصل بر يك روش ديگر اشاره مي‌كند كه به حلال هاي آلي يا دماي بالا نياز ندارد. پردازش اسفنج سازي گازي به طور مفصل به همراه نظريه آرايش (شكل گيري)، پارامترهاي ساخت و تركيب، كاربرد هاي اسفنج هاي گازي، قرار داد استاندارد تهيه و يك توضيح مختصر در مورد روش هاي توصيف آنها، تشريح مي شود.

روش قالب گيري حلال شامل انحلال PLGA در يك حلال آلي است (براي مثال كلريد متيلن) كه با يك پروژن قابل حل در آب كه معمولاً نمك است تركيب شده و محلول را در يك قالب سه بعدي از پيش مشخص قالب گيري مي كنند. سپس به حلال اجازه داده مي شود تا تبخير شده و داربست نهايي براي خارج سازي نمك پالايش مي شود كه اين امر سبب ايجاد خلل و فرج هايي با اندازه ابعاد ذرات نمك مي گردد، مزاياي اين روش پردازش عبارتند از: تخلخل كنترل شده كه توسط توده بلورهاي نمك موجود در تركيب تحميل مي‏شود اندازه خلل و فرج كه به وسيله ابعاد بلورهاي نمك كنترل مي گردد درجات مختلف بلورينگي كه توسط تركيب ويسكوزيته ذاتي پليمر تعيين مي شود و نرخ سطح به حجم كه به وسيله نسبت نمك به پليمر تعيين مي گردد. عيب اصلي اين روش استفاده از حلال هاي ‌آلي جهت قالب ريزي پليمر است كه مي توانند سبب كاهش فعاليت كاهش فعاليت مولكول هاي زيست القايي (براي مثال، پروتئين ها) شود كه بعد از ساخت نيز مي توانند به شكل مقادير كوچك باقي بمانند. روش ديگر شكل دهي داربست ها به كار گيري تفكيك فاز كنترل شده است. اين شيوه از مشخصه هاي تفكيك پليمر حل شده در حلال آلي (براي مثال، نفتالين مذاب) بهره مي برد. زماني كه PLGA و حلال به طور همگن آميخته شوند، فاكتور زيست فعال در تركيب وارد مي شود. با كاهش دماي تركيب، تفكيك فاز مايع- مايع القا شده و متعاقب آن هر فاز متبلور مي شود. مولكول زيست فعال در پليمر به دام افتاده و بخش آلي در اثر تصعيد خارج مي شود. مزاياي اين روش حفظ فعاليت زيستي مولكول هاي كوچك (براي مثال پپتيد) و توليد داربست هاي بزرگ تر است. در صورتي كه از گرما استفاده نشود مولكول هاي بزرگ تري كه در معرض از دست دادن ماهيت طبيعي هستند(براي مثال فاكتورهاي رشد ، آنزيم ها) به حلال هاي آلي وارد مي شوند. بدين ترتيب پردازش تفكيك فاز مي تواند منجر به از دست دادن (اتلاف) فعاليت اين مولكول ها گردد. علاوه بر اين ممكن است كه باقيمانده حلال آلي بر جاي بماند كه باعث لطمه زدن به زيست سازگاري داربست ها مي شود.

پردازش قالب ريزي مذاب از دماي بالا براي ذوب كردن PLGA و تركيب آن با پروژن استفاده كرده و تركيب به دست آمده در نهايت در شكل مورد نظر قالب ريزي مي شود. پروژن اين فرايند كه اغلب ميكروكره هاي ژلاتيني هستند پس از پالايش، يك داربست متخلخل از خود به جاي ميگذارند. اين روش داراي بسياري از مزاياي مشابه قالب گيري حلال از قبيل توانايي كنترل اندازه خلل و فرج و حد درجه تخلخل و بلورينگي مي باشد. مزيت ديگر اين روش عدم نياز به حلال هاي آلي است كه احتمال باقي ماندن حلال آلي راو در داربست ها از بين مي برد. شرايط دمايي بالا جهت ذوب PLGA مي تواند سبب تغيير ساختارهاي سه اتمي و چهار اتمي مولكول‏هاي زيستي مورد نياز براي فعاليت زيستي گردد.

-اسفنج سازي گازيGAS FOAMING                                                                      اسفنج سازي گازي فرايندي جهت پردازش PLGA در داربست هاي بسيار متخلخل است كه نه به دماهاي بالا و نه به حلال هاي آلي نياز دارد. اين امر سبب يكپارچگي مولكولهاي زيست فعال(براي مثال، پروتئين ها، پلاسميد DNA) با حداقل اتلاف فعاليت مي گردد. پردازش فوق شكل گيري يك داربست پيوسته PLGA ازتركيب اوليه گسسته ذرات PLGA(شكل 1-64) را ممكن مي سازد. ذرات PLGA و پروژن كه معمولاً كلريد سديم هستند با فشار بالاي به تعادل رسيده و پس از آن فشار  به سرعت كاهش مي يابد. افت فشار سبب تشكيل هسته حباب ها از  حاصل از عدم تعادل ترموديناميكي مي شود. به واسطه انتشار مقادير رو به افزايش گاز به حباب ها آنها منبسط گرديده و در نهايت منجر به انبساط ذرات پليمري منفرد در اطراف ذرات پروژن مي شود. ذرات ناپيوسته PLGA جهت شكل دهي يك ماده پيوسته با خلل و فرج باز گداخته مي شوند. پروژن به دست آمده را مي توان پالايش كرده تا يك داربست بسيار متخلخل با خلل و فرج هاي باز PLGA ايجاد شود، (شكل 2-64). اسفنج سازي گازي بسياري از پارامترهاي مشابه روشهاي ديگر پردازش را در برگرفته و بدين ترتيب داراي بسياري از مزاياي مشابه آنها از جمله كنترل اندازه خلل و فرج و تخلخل و توانايي ايجاد داربست هاي بزرگ مي باشد. بعلاوه، اين روش داراي مزيت هاي ديگري نيز هست. به واسطه تخلخل بالاي داربست چگالي هاي بالاي سلول ها را مي توان متناسب با تخلخل كم تركيب PLGA به دستگاه وارد كرد. بعلاوه تخلخل بالا مي تواند مشكلات ناشي از انتشار محدود مواد غذايي را به درون بافت در حال رشد و يا مواد زايد را از آن بافت به حداقل رسانده و بدين طريق زيست پذيري سلول را افزايش دهد. اسفنچ سازي گازي از نظر ساخت داراي يك مزيت است كه در آن ادامه پردازش قابل بررسي بوده و به پردازش دسته اي
 (batch processing)محدود نمي شود. شايد بزرگترين مزيت اين روش در شكل گيري داربست هاي PLGA در فقدان حلال هاي آلي و دماي بالا باشد. اين موضوع از آن جهت مهم است كه پروتئين ها در اثر تماس با حلال هاي آلي و در مرز بين حلال هاي آلي و بافر (تثبيت كننده) سيال  حاوي پروتئين از حالت طبيعي خارج مي شوند. پلاسميد DNA و پروتئين هاي بزرگ شامل فاكتورهاي رشد و آنزيم ها مي توانند با حداقل تخريب به شكل بالقوه درون داربست ها تجمع يابند. همچنين از آنجا كه هدف نهايي تهيه داربست ها ارائه آنها به عنوان جايگزيني هاي بافت يا دستگاههاي القايي جهت بازسازي بافت است، نبود پس ماندهاي آلي در داربست هاي اسنفج گازي يك مزيت قابل ملاحظه به حساب مي‌آيد.

-تئوريTHEORY                                                                                                 

جنبه حياتي اين فرايند هسته اي شدن و رشد خلل و فرج هاي گاز در حالت گاز در داربست ها است كه به ايجاد بي ثباتي ترموديناميكي همراه است. در چنين سيستمي سه نوع اساسي هسته اي شدن وجود دارد كه بر طبق تئوري كلاسيك هسته اي شدن عبارتند از: همگن، نامتجانس (هتروژن) و تركيبي به طور خلاصه هسته اي شدن همگن زماني رخ مي‏دهد كه مولكولهاي  كه در ابتدا در فشار بالا در پليمر حل شده اند در پاسخ به نيروي رانش ترموديناميكي به منظور تغيير فاز، تركيب شده و حباب هاي گازي كوچك همگني در كل پليمر ايجاد مي كنند تغييرات انرژي آزاد كنترل كننده اين فرايند با فشار گاز و انرژي سطح حد فاصل پليمر- حباب مرتبط است. در هنگام آزاد سازي فشار، در ابتدا حباب هاي  هسته اي شده و به اندازه بحراني مي رسند. انرژي آزاد حباب ها در اثر انبساط بيشتر حباب ها ناشي از انتشار  از پليمر اطراف به داخل حباب كاهش مي‏يابد. فرايند هسته اي شدن نامتجانس در اثر هسته اي شدن حباب هاي گاز در هر تعدادي از بين سطحي ها ايجاد مي شود، كه شامل بين سطحي گاز با پليمر، ذرات تجمع يافته درون اسفنج (براي مثال، NaCl، ساكروز) يا هر دو مي شود. اين بين سطحي ها از نظر ترموديناميك محل هاي مناسبي براي شكل گيري حباب ايجاد كرده و اين فرايند با مهار (كنترل) محل شكل گيري خلل و فرج ها مي تواند به طور بالقوه جهت كنترل ساختار خلل و فرج درون داربست ها به كار برده شوند. هسته اي شدن تركيبي، تركيبي از هسته اي شدن همگن و نامتجانس است. تصور مي شود كه هسته اي شدن تركيبي مكانيزمي باشد كه آرايش خلل و فرج راو در پردازش اسفنج گازي كه ناشي از اجزا متعدد در ديسك قالب گيري شده (PLGA , NaCl) است كنترل مي‌كند.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

-پارامترهاي ساخت و تركيب

پارامترهاي مختلفي، ساخت داربست هاي بسيار متخلخل PLGA را كنترل مي‌كند. از جمله اين پارامترها مي توان به نوع گاز به كار رفته و مقادير و مشخصه هاي پروژن اشاره كرد. داربست هاي اسفنج گازي توسط گاز  ساخته مي شوند. قابليت گازهاي ديگر (مانند )) نيز در ايچاد داربست هاي متخلخل مورد بررسي قرار گرفته اند كه البته با موافقت چنداني مواجه نشدند. تخلخل بالاي به دست آمده در هنگام استفاده از گاز  وابستگي زيادي به نرخ آزاد سازي فشار گاز ندارد. افزايش نرخ آزاد سازي اثري بر تخخل داربست نداشته در حاليكه آزادسازي بسيار سريع منجر به كاهش تخلخل تا حد 93% مي گردد. موفقيت هاي به دست آمده توسط گاز  در مقايسه با گازهاي ديگر تنها به خاطر حلاليت بالاي آن در پليمر است كه ناشي از بر هم كنش  با گروههاي كربونيل PLGA مي باشد.

تخلخل پذيري راو مي توان همچنين توسط پروژن موجود در ديسك با تغيير اندازه و مقدار بلورهاي NaCl كه متداول ترين پروژن هاي مورد استفاده هستند اصلاح كرد. معمولاً، NaCl  را تا ابعاد نسبتاً باريك (براي مثال450< d < 250) غربال كرده و با تغييير ابعاد غربال، اندازه خلل و فرج همزمان قابل تغييرات است. علاوه بر اين توسط درصد وزني NaCl تجمع يافته در اسفنج در طول پردازش تخلخل بالاتر نيز قابل حصول است. (براي مثال 98% > ، ام- سي- پيترز و دي- جي- موني مشاهدات ثبت نشده)

پارامترهاي ديگر ساخت كه شامل فشار اعمال شده به قالب كامپوزيت PLGA- NaCl و زمان مورد نياز براي پالايش NaCl (راندمان پردازش) مي شود هنوز به طول كامل مورد مطالعه قرار نگرفته اند و تصور نمي شود كه پارامترهاي اصلي كنترل اثر گذار بر خصوصيات مكانيكي داربست PLGA ، كنتيك هاي (جنبش هاي) فرسايش و تخلل باشند. البته عمل پالايش مستقيماُ بر نرخ رهايش پروتئين‏هاي تجمع يافته تأثير گذاشته و در «قرار داد تركيب» تشريح مي شود.

-كاربردهاي داربست هاي اسنفج گازي

USE FOR GAS-FOAMED SCAFFOLDS                                                            بر اساس ويژگي اول، فرايند اسفنج سازي گازي در شكل دهي اسفنج هاي PLGA اين كامپوزيت‏ها با موفقيت قابل ملاحظه اي در دستگاههاي رهايش، پروتئين هاي هدف ياب (ردياب) و DNA پلاسميد، و فراكاشت سلولي به كار گرفته شده اند. رهايش پروتئين يكي از كاربردهاي اسنفج هاي گازي است. پروتئين ها (براي مثال فاكتورهاي رشد) را مي توان در خلال مرحله ساخت درون يك ديسك مجتمع كرده و به شكل كنترل شده اي آزاد ساخت (رهايش كرد). پروفيل (نمودار) يك آزادسازي معمولي از ديسك در شكل 3-63 نشان داده شده است. اين نمودار آزادسازي كنترل شده پيوسته فاكتور رشد عروقي (VEGF) را كه براي گسترش عروق خوني مهم است را نشان مي دهد. حائز اهميت است كه VEGF آزاد شده از داربست هاي اسفنج گازي، فعاليت زيستي بالايي را هم در محيط آمايشگاه و هم درون بدن حفظ مي‌كند. اين امر حاكي از آن است كه پروتئين هاي پيچيده و بزرگ ديگر نيز را بتوان به آساني با استفاده از اسفنج هاي گازي آزاد ساخت. فعاليت هاي اخير با بسط بررسي هاي فوق PLGA را توسط كاني سازيmineralization)) اصلاح كرده و داربست هاي PLGA غني از فسفات كلسيم حاوي VEGF را براي مهندسي بافت استخوان ارائه كرده است.

علاوه بر پروتئين ها DNA پلاسميد را نيز مي توان با موفقيت آزاد كرد. اخيراً يك پلاسميد كد شده پلاكت مشتق شده فاكتور رشد كه از ديسك هاي اسفنج گازي PLGA آزاد شده است هم در آزمايشگاه و هم در داخل بدن مورد مطالعه قرار گرفته است. DNA پلاسميد تجمع يافته در داربست، منجر به راندمان بالاي انتشار شده كه نشان دهنده اشغال DNA فعال و تغيير شكل پروفيل ژن هاي آنها توسط ارتقاء رشد و تفكيك سلول هاي داربست و ايجاد فاكتورهاي آنژيوژنيك لازم جهت حفظ و ادامه رشد بافت هاي بزرگ مطرح مي‌كند.

اسفنج هاي گاز نيز براي استفاده به عنوان دستگاههاي فراكاشت سلول مورد بررسي قرار گرفته اند. فراكاشت سلول ممكن است بتواند از نظر كاركردي معادل ساختارهاي بافت مورد استفاده به عنوان جايگزين قسمتي از اندام و يا براي الگوهاي بازسازي عمل كند. البته روش هاي فراكاشت سلول در اثر جابجايي مواد غذايي به درون و مواد زائد به خارج از بخش دروني داربست محدود شده وبدين ترتيب وجود يك سيستم عروقي براي بقاي سلول هاي كاشته شده و رشد بافت هاي بزرگ تر كه براي حفظ عملكرد خود بر سيستم خون رساني كامل نيازمندند ضروري است. يك سيستم عروقي كارآمد مي تواند در اثر تركيب فراكاشت سلول با سلول آنژيوژنيك رها شده از داربست ها، افزايش (رشد) يابد. تحقيقاتي كه از روش هاي مختلف پردازش براي شكل دهي ساختارهاي بافت غضروف، چربي، و استخوان استفاده مي كنند نشانگر پتانسيل بزرگ PLGA در شكل دهي انواع مختلف بافت ها است.

 

 

-قرارداد تهيهPREPARATION PROTOCOL                                                                                       

اين بخش، قرارداد متعارف تهيه داربست PLGA را به وسيله پردازش اسفنج گازي تشريح مي‌كند. اين فرايند توسط شكل گيري ديسك كامپوزيتي PLGA- NaCl اوليه، اسفنج سازي گازي ديسك به وسيله  وپالايش جهت ايجاد داربست متخلخل مورد تأكيد قرار مي گيرد. اين قرارداد در مورد اسفنجي با ضخامت mm3 و شعاع mm13 ارائه شده است.

-شكل گيري ديسك DISK FORMATION                                                            

براي ايجاد يك ديسك mm3*mm13، كلاً mg800 ماده مورد نياز است كه به طور معمول شامل mg760، NaCl و mg40، PGLA مي شود. همچنين پروژن هايي مانند ساكروز و غيره نيز مي توانند شامل اين آرايش باشند. نسبت نمك (ياساكروز) به پليمر منجر به يك داربست بسيار متخلخل با استحكام مكانيكي مناسب (kPa 75 >مدول فشاري) مي گردد. در صورتي كه متحتويات PLGA به طور قابل ملاحظه اي كاهش يابد، اسفنج ها استحكام مكانيكي و تخلخل پذيري ناپايداري از خود نشان مي دهند. NaCl پالايش شده (غربال شده) (425 < d <   106). اين تركيب به صورت فشاري در قالب اسفنج به مدت 1 دقيقه در psi1500 با استفاده از پرس كارور قالب گيري شده تا شكل ديسك راو به خود گيرد. در صورتيكه داربست مي بايست حاوي پروتئين نيز باشد مي توان حجمي از پروتئين حل شده در بافر را در لوله شيشه اي سيليكوني كه با  مايع منجمد شده و قبل از تركيب با NaCl خشك شده است به PLGA اضافه نمود.

-اسفنج سازي گازيGAS FOAMING                                                                   

 پس از اتمام قالب گيري فشاري NaCl - PLGA ( پروژن) به درون ديسك، كامپوزيت در ظرف فشار قرار مي گيرد. (شكل 1-64). فشار  تا حداقل psi800 براي تعادل با ديسك PLGA افزايش مي يابد. زمان تعدل بايد حداقل 16 ساعت باشد تا از حل شدن مناسب  قبل از آزاد شدن فشار اطمينان حاصل شود. بعد از اين مدت نگهداري با ، فشار در طول 3-2 دقيقه آزاد مي گردد. نرخ آزاد شدن گاز تغيير چنداني در يكپارچگي اسنفج ها ايجاد نمي كند، هر چند نرخ آزاد سازي سريع ممكن است بر تخلخل اسفنج تأثير بگذارد.

-پالايشLEACHING                                                                                             پروژن از ديسك مربوط به اسفنج گازي پالايش مي شود. اين فرايند منجر به ايجاد خلل و فرج هاي درهم و باز عاري از پروژن مي گردد. اسفنج هاي شكل گرفته با استفاده از mg760 NaCl براي هر ديسك (mm3*mm13) با ml25 آبي كه دوبار تقطير شده است، پالايش مي شود. نكته مهم براي كاربرد تحليل ثبات زمان پالايش است كه در طول آن در كامپوزيت معين NaCl - PLGA ، پالايش NaCl با نرخ قابل پيش بيني رخ داده و آزاد سازي پروتئين به طور همزمان اتفاق مي افتد. بنابراين داربست ها تنها براي 24 ساعت پالايش مي شوند كه قبل از اين موعد پالايش NaCl پايان يافته است. پالايش اضافي بر تخريب و فرسايش ديسك PLGA تأثير گذاشته و از آن مهم تر سبب آزاد سازي پروتئين مي گردد. به منظور سنجش دقيق پروتئين تجمع يافته و كنتيك‏هاي آزاد شده و نيز پيش بيني غلظت پروتئين در هر زمان آزمايش مي بايست پارامترهاي اوليه موجود در قرارداد آزمايشگاهي راو به اجرا درآورد. پس از اتمام پالايش ديسك ها شاخص بندي مي شوند (براي مثال با توجه به تخلخل، آزادسازي پروتئن و غيره).

-شاخص بنديCHARACTERIZATION                                                               فاكتورهاي متعددي بر پردازش و يكپارچگي نهايي ديسك هاي اسنفج گازي PLGA تأثير مي گذارند. پس از ساخت يك شاخص اوليه جهت ارزيابي يكپارچگي ديسك، استحكام مكانيكي، تخلخل، آزادسازي فاكتورها و پروفيل تخريب صورت مي گيرد. ميركروسكوپ اسكن الكترون (SEM) تحليل مورفولوژي نابهنجار در ديسك راو ممكن ساخته و ثبت بصري از خلل و فرج هاي شكل گرفته، ايجاد مي‌كند. حدود مقياس در دسترس توسط SEM، تصوير بزرگ و جزئيات ميكروساختارهاي ديسك راو ميسر مي‌كند. جهت ارزيابي خصوصيات مكانيكي (براي مثال، مدول فشاري) ديسك ها در معرض تست هاي مكانيكي قرار مي گيرند تا تغيير شكل ديسك در پاسخ به تنش اعمال شده اندازه گيري شود. تخلخل سنجي براي اندازه گيري حجم حفره ساختار سه بعدي انجام مي شود. تخلخلي تركيبي است از خلل و فرج هاي بسته و باز كه از طريق SEM قابل شناسائي بوده و بوسيله اندازه گيري حجم تحميلي جيوه سنجيده مي شود. همچنين، ميكروسكوپي نيروي اتمي نيز جهت كسب اطلاعات جامع تر در مورد ساختار خلل و فرج قابل استفاده است. تخريب و فرسايش PLGA به عنوان تابعي از اتلاف توده ديسك يا اتلاف يكپارچگي مكانيكي با زمان قابل اندازه گيري است.

-چكيده

پردازش اسنفج گازي پليمرها در ماتريس هاي مهندسي بافت داراي مزاياي منحصر به فردي است كه از آن جمله ميتوان شكل دهي داربست هاي حاوي فاكتورهاي زيست فعال را نام برد. حذف شرايط حلال هاي آلي و دمايي بالاي ساخت، قابليت رهايش مولكولهاي بزرگ و پيچيده مانند فاكتورهاي رشد، آنزيمها و DNA پلاسميد را با حذف فعاليت زيستي جهت ارتقاء كاربردهاي القايي مهندسي بافت ميسر مي سازد.